Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
неперемешиваемого слоя, малый коэффициент диффузии).
При этих условиях:
V
(
h
s
o
)
[S][S]
K
[S]
ll
m
(4.8)
(h
= Ds/l – коэффициент массопереноса субстрата), откуда
s
концентрация субстрата на границе раздела фаз:
[S]
h
s
o
[S]
l
h
s
V
max
K
m
(4.9)
а экспериментально наблюдаемая скорость ферментативного процесса (то есть накопление продукта реакции в растворе):
V
max
'
v
K
m
'
[S][S]
k
l
o
(4.10)
Эффективная константа скорости первого порядка k’ определяется уравнением:
V
max
h
s
K
'
k
m
V
max
h
s
K
m
1
1
K
m
V
h
s
max
(4.11)
Как видно из уравнения (4.11), если h
>>V
s
max/Km
(то есть
массоперенос идет быстрее каталитической реакции), то k’
= V
max/Km
, определяемой по уравнению (4.6)). Напротив, если
v
кин
<<V
h
s
диффузия), то k’ = h
и реакция протекает в кинетическом режиме (v’ =
max/Km
(химическая реакция идет много быстрее, чем
и наблюдаемая реакция является диф-
s
121
фузионно контролируемой (v’ = v
, определяемой по урав-
диф
нению (4.5)). Точное решение уравнения (4.7) относительно
[S]
и его последующий анализ показывает, что необходи-
l
мым и достаточным условием работы фермента в диффузионном режиме является соотношение:
lV
max
θ
[S]
D
o
1
s
(4.12)
На практике наличие внешнедиффузионных затруднений
может сильно осложнить интерпретацию кинетических данных при работе с препаратами иммобилизованных ферментов. В кинетическом режиме справедливо уравнение (4.6),
реакция будет описываться обычным уравнением Михаэлиса-Ментен, и в координатах Лайнуивера-Берка мы получаем
привычную прямолинейную зависимость скорости реакции
от концентрации субстрата в растворе (
рис. 4.3, кривая 1).
Если же реакция диффузионно-контролируемая (выполняется соотношение (4.12)), то зависимость наблюдаемой скорости от концентрации субстрата будет подчиняться уравнению (4.5). Иными словами, в координатах Лайнуивера-Берка
такая зависимость будет представлять собой прямую, идущую из начала координат (рис. 4.3, кривая 2).
1/V
2
1
1/[S]
Рис. 4.3. Зависимость скорости реакции иммобилизованного фермента
от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка при работе
в кинетической (1) и диффузионной (2) областях
122
Практический пример влияния внешнедиффузионных за-
V
труднений на наблюдаемую кинетику действия иммобилизованного фермента приведен на рисунке 4.4.
0,25
3
0,20
0,15
0,10
/dt, мин*10
650
0,05
-dA
-20246
1/A
650
, усл.ед
7,5 8,0 8,5 9,0
1
2
pH
А Б
Рис. 4.4. Скорость лизиса клеток Microcoocus luteus иммобилизованным
на агарозе лизоцимом. (А) Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (клеток) в координатах Лайнуивера-Берка. (Б) рНзависимость лизиса клеток Microcoocus luteus иммобилизованным на
агарозе лизоцимом в кинетическом (1) и
17
диффузионном (2) режимах
На зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка (рис. 4.4, А) четко
выделяются два участка, соответствующие диффузионному
(при низких концентрациях субстрата) и кинетическому
(при высоких концентрациях субстрата) режимам функцио-
нирования иммобилизованного лизоцима. В той же работе
продемонстрирован еще один эффект влияния внешней
диффузии на ферментативную реакцию –
наблюдаемое изменение рН-профиля действия фермента (рис. 4.4., Б). В кинетическом режиме, когда наблюдаемая скорость процесса
определяется ферментативной реакцией (уравнение (4.6)),
фиксируется традиционная для функционирования фермен-
17
Адаптировано из: A.P.Levashov, D.A.Matolygina, E.D.Ovchinnikova,
I.Yu.Adamova, D.A.Gasanova, S.A.Smirnov, V.A.Nelub, N.G.Belogurova,
V.I.Tishkov, N.L.Eremeev, A.V.Levashov. The bacteriolytic activity of native and covalently immobilized lysozyme against Gram-positive and Gramnegative bacteria is differentially affected by charged amino acids and glycine. – FEBS Open Bio, 2019, v.9, N 3, p.510–518
123
тов колоколообразная рН-зависимость (рис. 4.4, Б, кривая
1). Однако коэффициент диффузии веществ очень слабо за-
висит величины рН среды. Поэтому при работе в диффузионном режиме (скорость процесса зависит именно от величины коэффициента диффузии субстрата) наблюдаемый
рН-профиль «размывается» и практически пропадает (рис.
4.4, Б, кривая 2).
Перевод ферментативной реакции из диффузионного
режима в кинетический на практике осуществляют при помощи улучшения гидродинамики системы. Толщина неперемешиваемого слоя l уменьшается при увеличении интенсивности перемешивания гетерогенной реакционной среды
или скорости прокачки раствора субстрата в колонках (капиллярах). В большинстве случаев улучшение гидродинамики системы позволяет практически устранить внешнедиффузионные эффекты при
работе с иммобилизованными
ферментами.
Внутридиффузионные эффекты в ферментативной
кинетике. Проанализируем кинетические закономерности
протекания ферментативных процессов, осложненных массопереносом субстрата внутри твердой фазы в предположении, что внешнедиффузионные эффекты отсутствуют. Рассмотрим частицу, находящуюся в растворе субстрата и в
которой фермент распределен по всему ее объему. В этом
случае для протекания реакции необходимо, чтобы субстрат
не только достиг поверхности данной
частицы, но и продиффундировал внутрь. Процессы диффузии и катализа (в
отличие от внешнедиффузионных затруднений) идут в частице одновременно, поэтому при математическом рассмотрении подобных моделей учитываются скорости обеих реакций:
]S[]S[]S[
lll
ttt
киндиф
(4.13)
124
где [S]l – концентрация субстрата в данной точке внутри
частицы с иммобилизованным биокатализатором.
Если диффузия описывается законом Фика (то есть коэффициент диффузии субстрата D внутри носителя не зависит от концентрации диффундирующего вещества и одинаков по всему объему частицы), то скорость изменения концентрации субстрата за счет диффузии можно записать как:
]S[
l
t
диф
[S]D
lS
(4.14)
где – оператор Лапласа. В ряде частных случаев (плоская
мембрана, стержень, сфера) задача становится одномерной
и уравнение (4.14) упрощается:
2
]S[
l
t
диф
D
S
n
2
x
]S[]S[
ll
xx
(4.15)
Здесь n принимает значение, равное нулю для мембраны,
единицы для стержня и двойки для сферы, а x является координатой по толщине в случае мембраны или по радиусу
для стержня и сферы.
В той же точке частицы протекает ферментативный процесс трансформации субстрата:
t
кин
'
V
K
max
'
m
]S[]S[
ll
]S[
l
(4.16)
Предположим, что V’
и K’m (максимальная скорость ре-
max
акции и константа Михаэлиса иммобилизованного фермента) постоянны по всему объему частицы и не меняются в
результате образования продуктов реакции. Тогда при достижении стационарного режима скорости диффузионного и
кинетического процессов будут равны между собой и в са-
125
мом простом случае (для плоской мембраны) можно запи-
сать:
'
V
K
max
'
m
]S[
l
l
(4.17)
D
2
S
]S[
2
x ]S[
Из уравнения (4.17) видно, что осложненные внутренним
массопереносом субстрата ферментативные процессы могут
протекать в нескольких различных режимах. Первый крайний случай – кинетический режим – реализуется тогда, когда скорость химической реакции крайне мала. Тогда градиент концентрации субстрата (движущая сила массопереноса) незначителен, субстрат успевает «доставляться» во
внутренние области
частицы и его концентрация [S]l практически постоянна в объеме носителя. Наблюдаемая скорость процесса (изменение концентрации продукта в растворе) в данном случае определяется исключительно каталитическими свойствами иммобилизованного фермента. В
диффузионном режиме (когда скорость ферментативной
трансформации субстрата очень велика) весь субстрат будет
расходоваться в приповерхностных слоях частицы и биокатализатор, находящийся в глубинных
областях носителя,
функционировать не будет. Наблюдаемая скорость реакции
зависит не от количества фермента внутри частицы, а от
диффузионных параметров субстрата.
Чтобы понять, в каком именно режиме работает иммобилизованный фермент, удобно использовать так называемый
фактор эффективности реакции:
= V
набл/Vo
(4.18)
где V
– скорость ферментативного процесса в отсутствие
o
внутридиффузионных затруднений (когда концентрация
субстрата во всем объеме частицы постоянна). Понятно, что
= 1 реакция протекает в кинетическом режиме, а при
при
<< 1 – в диффузионном.
126
В 1939 году, при решении проблем гетерогенного ката-
/
лиза, В. Тиле показал
представить как функцию безразмерного модуля
18
, что фактор эффективности можно
:
= tg(
)
(4.19)
Безразмерный модуль
, зависящий от коэффициента диффузии, константы скорости и размера частицы катализатора,
получил название модуля Тиле (следует отметить, что аналогичные результаты независимо от работы Тиле были
опубликованы в том же году советским ученым
Я.Б.Зельдовичем
19
). Для гетерогенных ферментативных
процессов модуль Тиле имеет вид:
'
V
max
a
K
'
D
m
S
(4.20)
В данном уравнении параметр а отражает геометрические
характеристики частицы катализатора – толщину для мем-
браны или радиус для сферы. Если модуль Тиле
реакция протекает в диффузионном режиме, если же
>> 1, то
<< 1,
то режим протекания реакции кинетический.
Из уравнения (4.20) ясно видны экспериментальные возможности уменьшения абсолютной величины модуля Тиле,
то есть пути перевода ферментативной реакции из диффузионного режима в кинетический. Это в первую очередь
уменьшение локальной концентрации иммобилизованного
биокатализатора (то есть снижение величины V’
). На ри-
max
сунке 4.5, например, приведены данные по зависимости наблюдаемой скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата щелочной фосфатазой, включенной в частицы поли-N-
18
W. Thiele. Relation between catalytic activity and size of particle. –
Ind.Eng.Chem., 1939, v.31, N 7, p. 916–920.
19
Я. Б. Зельдович. К теории реакции на пористом или порошкообразном мате-
риале. – Ж.физ.химии, 1939, т.13, № 2, с. 163–168.
127
изопропилакриламидного геля, от исходной концентрации
фермента в растворе при проведении иммобилизации. Как
-7
видно, в области концентраций 2.58ꞏ10
М наблюдаемая
активность препарата слабо зависит от концентрации щелочной фосфатазы (диффузионный режим реакции). При
дальнейшем уменьшении концентрации биокатализатора
данная зависимость прямолинейно стремится в начало координат (кинетический режим реакции).
Применение «плохих» субстратов (субстратов с невысокими k’
и большими K’m) также способствует переводу
кат
ферментативного процесса в кинетический режим. Однако
этот момент имеет исключительно теоретическое значение. Если речь идет о промышленных биотехнологических
процессах, то есть получении конкретного продукта, то
кинетические параметры субстрата изменить невозможно.
0,020
0,015
0,010
0,005
A, мМ/мин*г геля
0,000
02468
[E]ꞏ107, M
Рис. 4.5. Зависимость наблюдаемой скорости гидролиза
п-нитрофенилфосфата щелочной фосфатазой, включенной в частицы
поли-N-изопропилакриламидного геля, от исходной концентрации фер-
мента в растворе при проведении иммобилизации
20
Адаптировано из: Н. Л. Еремеев, Л. В. Сиголаева, П. А. Симаков, Н. Ф. Ка-
занская. – Температурное поведение равновесных и кинетических констант
ферментативных реакций при фазовом переходе в термочувствительной матрице. – Биохимия, 1995, т. 60, N 8, с. 1307–1317.
128
20
Изменение размеров частиц носителя с иммобилизованным внутри него ферментом является на практике наиболее
простейшим приемом определения области функционирования биокатализатора. Если удельная активность (скорость
реакции, отнесенная к объему катализатора) не зависит от
размера используемых частиц, это означает работу в кинетическом режиме. Если же исходно катализатор функционирует в диффузионной
области, то уменьшение размера частиц
носителя будет приводить к увеличению удельной активности иммобилизованного фермента. Именно с этим и связано
интенсивное развитие исследований по получению наноразмерных носителей для применения в промышленности.
21
Диффузионный режим работы иммобилизованного фермента в ряде случаев приводит к наблюдаемому эффекту
увеличения стабильности препарата. Многоточечное сорбционное или ковалентное связывание белка с носителем
предотвращает его денатурацию, фиксируя трехмерную
конформацию глобулы. Однако длительное сохранение активности наблюдалось и для препаратов, полученных методами физического включения, когда взаимодействие фермента
с носителем отсутствует. Как уже говорилось выше,
высокая концентрация иммобилизованного биокатализатора
переводит систему в диффузионный режим, где наблюдаемая активность препарата слабо зависит от концентрации
фермента (рис. 4.5). Таким образом, иммобилизованный белок может инактивироваться с той же скоростью, что и в
растворе, но это не будет сказываться на активности препа-
до тех пор, пока система работает в диффузионном ре-
рата
жиме. Только тогда, когда концентрация фермента в препарате уменьшится настолько, что система перейдет в кинетический режим, можно будет наблюдать реальную инактивацию фермента. Схематически этот феномен продемонстрирован на рисунке 4.6.
21
M. Razzaghi, A. Homaei, F. Vianello, T. Azad, T. Sharma, A. K. Nadda, R.
Stevanato, M. Bilal, H. M. N. Iqbal. Industrial applications of immobilized nanobyocatalysts. – Bioproc.Biosyst.Eng., 2022, v.45, p. 237–256.
129
1,0
l
0,8
0,6
0,4
0,2
Остаточная активность
0,0
время
Рис. 4.6. Схематическое представление зависимости остаточной актив-
ности нативного (●) и иммобилизованного (о) фермента от времени
Даже в отсутствие внешне- и внутридиффузионных затруднений матрица может оказывать влияние на кинетику
действия иммобилизованного фермента. Это связано с тем,
что в эксперименте исследователи обычно могут измерять
только макрохарактеристики реакции на основе анализа наблюдаемых активностей биокатализатора, задавая экспериментально некоторые исходные концентрации веществ в растворе и, соответственно,
в растворе же измеряя скорости
убыли субстрата или накопления продукта ферментативной
реакции от времени. Однако определяемые активности, помимо всего прочего, зависят еще и от
эффектов распреде-
ления субстратов, продуктов, заряженных ионов и т. д. меж-
ду раствором и фазой носителя. Подобные эффекты после
достижение равновесия в системе описываются коэффициентом распределения P:
P = C
/Co (4.21)
130
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]