Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
водимых живыми организмами. В то же время при получении конкретных химических веществ такое разнообразие
продуктов является отрицательным фактором, поскольку
снижает выход целевого вещества и усложняют процессы его
очистки. В этой связи логика развития подобных производств требует перехода от исходного биокатализаторамикроорганизма к ферменту, непосредственно катализирующему требуемую реакцию трансформации
исходных веществ в конечный продукт. Так, получение L-аспарагиновой
кислоты первоначально осуществлялось при помощи клеток
E.coli. В настоящее время этот процесс осуществляется с использованием иммобилизованной аспартазы.
Приведем две цитаты из научной литературы. «В промышленном применении наиболее значимыми ферментами
являются гидролазы (амилазы, протеиназы, липазы). Липазы
применяются максимально широко ввиду
их высокой каталитической активности, стабильности и способности катализировать большое количество самых разнообразных реак-
12
ций»
. «Продукты промышленных процессов с использова-
нием липаз составляют 40 % всех веществ, получаемых при
помощи ферментов»
13
.
Эти высказывания подтверждаются данными таблицы 4.1,
в которой приведены наиболее крупнотоннажные производства продуктов на основе ферментов. При этом три из восьми
процессов проводится при помощи липаз. В этой связи имеет
смысл более подробно остановится на липазах и их использовании в промышленности. Однако в начале несколько слов
о производствах с
использованием других ферментов.
12
D. G. Filho, A. G. Silva, C. Z. Guidini. Lipases: sources, immobilization
methods and industrial applications. – Appl.Microbiol.Biotechnol., 2019,
V.103, p.7399–7423.
13
M.Bilal, C. D. Fernandes, T. Mehmood, F. Nadeem, Q. Tabassam, L. F. R.
Ferreira. Immobilized lipases-based nano-biocatalytic systems – A versatile
platform with Incredible biotechnological potential. – Int.J.Biol.Macromol.,
2021, V.175, p.108–122.
91
Таблица 4.1.
Крупнотоннажные производства с использованием
ферментов
14
Фермент
*α-Амилаза
Глюкозоизомераза
Липаза 3.1.1.3
*Лактаза 3.2.1.108 Гидролиз лактозы
Липаза 3.1.1.3
*Пенициллин G
ацилаза
*Аспартаза 4.3.1.1
*Термолизин 3.4.24.27 Синтез аспартама
Липаза 3.1.1.3
Номер
КФ
3.2.1.1
5.3.1.5
3.5.1.11
Процесс
Получение сиропов
с высоким содер-
жанием фруктозы
из крахмальных
гидролизатов
Утилизация масло-
содержащих отхо-
дов производства
Производство био-
дизельного топлива
Получение анти-
биотиков
Получение L-
аспарагиновой ки-
слоты из фумаро-
вой кислоты
Разделение хираль-
ных спиртов
Объем
продукции
(тонн/год)
107
105
105
104
104
104
104
103
*Процессу посвящен отдельный раздел в: Р. Шмид. Нагляд-
ная биотехнология и генетическая инженерия. – М.: Лаборатория знаний, 2020. – 324 с.
14
согласно R.DiCosmo, J.McAuliffe, A.J.Poulose, G.Bohlmann. Industrial
use of immobilized enzymes. – Chem. Soc. Rev., 2013, V.42, N 15, p.6434–
6474
92
Гидролиз крахмала α-амилазой с последующей изомеризацией глюкозы во фруктозу под действием глюкозоизомеразы приводит к получению сиропов с высоким содержанием фруктозы. Под коммерческим названием «патока» этот
продукт широко используется в пищевой промышленности
в качестве подсластителя (фруктоза в 1,25 раза слаще глюкозы и в 1,5 раза слаще сахара).
Лактоза (молочный
сахар, дисахарид β-Dгалактопиранозил-(1,4)-β-D-глюкопираноза) содержится в
молоке и расщепляется в желудочно-кишечном тракте ферментом лактазой. Отсутствие у человека этого фермента вызывает так называемую непереносимость лактозы – энзимопатию, вызывающую диарею, вздутие живота, тошноту и
рвоту после употребления молочных продуктов. Предварительный гидролиз лактозы позволяет получать «обезлактоженные»
молочные продукты, которые могут употреблять в
пищу люди с такой проблемой.
Пенициллин G ацилаза катализирует образование 6аминопенициллановой кислоты (6-АПК) снятием в мягких
условиях бензильной группировки с природного бензилпенициллина (пенициллина G). Последующее ацилирование
свободной аминогруппы 6-АПК дает возможность синтеза
новых антибиотиков пенициллинового ряда.
Процесс получения L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты при помощи
аспартазы непосредственно связан
с выработкой аспартама при помощи термолизина. Аспартам – метиловый эфир L-аспартил-L-фенилаланина – вещество, в 200 раз слаще сахара и применятся при производстве
диабетических продуктов.
Вернемся к использованию липаз. Физиологическая роль
липазы (ЕС 3.1.1.3, систематическое название триацилглицерол:ацилгидролаза) в любом организме – это гидролиз
природных триглицеридов (жиров и масел).
В зависимости
от источника липазы проявляют различную специфичность
по отношению к длине жирной кислоты в триглицериде, а
также различную региоселективность – неспецифичные
93
липазы гидролизуют все три сложноэфирные связи, в то
время как sn-1,3-специфичные гидролизуют в триглицериде
только связи у крайних атомов углерода и не способны гидролизовать сложноэфирную связь у центрального атома.
По своей трехмерной структуре липазы относятся к ,-
гидролазам, содержащим 8 -листов и 6 -спиралей. Каталитическая триада липаз
– Ser/His/(Asp/Glu) – аналогична
другим сериновым гидролазам. Помимо своих природных
субстратов липазы способны гидролизовать большой спектр
сложных эфиров карбоновых кислот с весьма различной
структурой ацильной и спиртовой частей.
Гидролитические свойства липаз находят применение в
фармацевтической промышленности при создании пищеварительных ферментных препаратов (подробнее см. в разделе 5). Сама по себе липаза, как пищевая
добавка Е1104 используется в пищевой промышленности для ароматизации
продуктов питания в хлебопечении, сыроделии, производстве сыровяленых колбас. Одним из компонентов пищевой
добавки 471 (пищевой эмульгатор) являются моноацилглицериды, получаемые гидролизом триглицеридов sn-1,3специфичными липазами.
В непищевых областях гидролитические свойства липаз
позволяют переводить исходно гидрофобные природные
триглицериды в более растворимые продукты, то
есть избавляться от жиров и масел. Так, стиральные порошки с добавкой липаз более эффективно удаляют с тканей жировые
пятна. Косметические средства для ухода за кожей и волосами на основе липаз способствуют очищению кожи от жировых отложений в мягких условиях. Необходимость обезжиривания шкур и бумажной пульпы
обуславливает применение липаз в кожевенной и бумажной промышленности.
Утилизация маслосодержащих отходов производства при
помощи липаз (таблица 4.1) является гораздо более эффективным и экологически чистым процессом по сравнению с
традиционно используемым кислотным гидролизом – в
2001 году компания Novozyme за технологию обезжирива-
94
ния хлопкового волокна получила премию Presidential Green
Chemistry Challenge Award от Environmental Protection
Agency США (в 21-м веке в США ежегодно вручается одна
такая премия за внедрение технологий, максимально снижающих антропогенную нагрузку на окружающую среду).
При переходе к средам на основе органических растворителей с низким содержанием воды гидролитические реакции липаз обращаются в синтетические (таблица 4.2).
Таблица 4.2.
Реакции липаз в средах с низким содержанием воды
Этерификация
R
COOH + R2OH = R1COOR2 + H2O
1
Трансэтерификация – алкоголиз
R
COOR2 + R3OH = R1COOR3 + R2OH
1
Трансэтерификация – ацидолиз
R
COOR2 + R3COOH = R3COOR2 + R1COOH
1
Интерэтерификация
R
COOR2 + R3COOR4 = R1COOR4 + R3COOR2
1
Аминолиз
R
COOR2 + R3NH2 R1CONHR3 + R2OH
1
Этерификация приводит к образованию сложных эфиров
карбоновых кислот. Многие сложные эфиры достаточно простой структуры в низких концентрациях обладают характерным запахом (например, изоамилацетат – грушевый запах,
метилантранилат – апельсиновый запах, этилвалерат – запах
зеленых яблок и т. д.) и применяются как ароматизаторы в
пищевой промышленности, косметики, производстве освежающих и ароматизирующих средств. Глицериды
феруловой кислоты эффективно поглощают ультрафиолетовые лучи и являются основой кремов от загара. В производстве
косметических средств широко используются неионные
ПАВ на основе сахаров и полиолов (такие, как фруктозобу-
95
тират или сорбитолмоностеарат), не раздражающие кожу
ввиду отсутствия диссоциирующих групп. В тех же косметических кремах сложные эфиры «длинных» жирных кислот и спиртов (миристилмиристат, децикокоат и т. п.) с успехом заменили вазелиновые масла – продукты нефтепереработки. Внедрение этой технологии компанией Eastmen
Chemical Co. было отмечено присуждением Presidential
Green Chemistry Challenge Award за 2009 год.
Наиболее крупномасштабная выработка
продукта в ре-
зультате алкоголиза производится в процессе получении
биодизельного топлива (таблица 4.1). Метанолиз природных
растительных масел дает в результате метиловые эфиры
жирных кислот, которые по своему составу являются аналогами традиционного дизельного топлива. Особое внимание
этому процессу уделяет Европейский союз, поскольку растительные масла – продукт возобновляемый, и расширение использования
биодизельного топлива позволяет снижать по-
требности в нефтепродуктах и самой сырой нефти.
Маргарин – продукт гидрирования непредельных жирных кислот в растительных маслах, что обеспечивает повышение температуры плавления триглицеридов. Однако в
ходе гидрирования в жирных кислотах появляются двойные
связи, находящиеся в транс-конфигурации (в природных
маслах все двойные связи присутствуют в
цис-
конфигурации). В свою очередь, присутствие в продуктах
питания транс-изомеров жирных кислот резко повышает
риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний.
Ацидолиз подсолнечного масла смесью стеариновой и пальмитиновой кислот позволяет получать свободный от трансизомеров маргарин (Presidential Green Chemistry Challenge
Award за 2005 год, компании ADM и Novozyme).
Интерэтерификацией пальмового масла тристеарином
(SSS) с помощью sn-1,3-специфичных липаз
получают искусственное масло какао. Основной компонент триглицеридов какао имеет состав SOS, а в пальмовом масле преобладает триглицерид РОР (О – остаток олеиновой кислоты,
96
S – остаток стеариновой кислоты, Р – остаток пальмитиновой
кислоты). Конечный продукт, таким образом, содержит определенное количество триглицерида SOS. Аминолиз используется для получения N-ацилированных аминокислот -ПАВ
для косметической промышленности.
Отдельно следует выделить способность липаз к кинети-
ческому разделению хиральных веществ, что в настоящее
время широко применяется при производстве лекарственных препаратов (таблица 4.1).
Химический синтез обычно
приводит к рацемической смеси стереоизомеров продукта
реакции. Физические свойства энантиомеров одинаковы,
однако биологическая активность часто сильно различается
(например, ибупрофен, нестероидный противовоспалительный препарат, активен только в виде S-(+)-изомера). Этот
факт требует выделения активного начала в чистом виде и
разделение энантиомеров традиционно поводится жидкостной хроматографией на хиральных
сорбентах или хиральной модификацией подвижной фазы, что является весьма
дорогостоящей процедурой. Смысл кинетического разделения стереоизомеров заключается в том, что в параллельных
реакциях отношение концентраций конечных продуктов
определяется отношением соответствующих констант скоростей реакций (см. Приложение 3). При гидролизе сложных эфиров или этерификации рацемической смеси энантиомеров фермент предпочтительно взаимодействует
с одним из изомеров. В результате один из компонентов рацемической смеси накапливается в основном в виде эфира, а
второй – в виде кислоты или спирта. Это позволяет использовать для хроматографического разделения продуктов реакции достаточно простые сорбенты. На основе подбора
липазы требуемой специфичности разработаны и применяются технологии
кинетического разделения рацематов оптических изомеров для получения индивидуальных веществ
с чистотой 95–98 %.
97
4.2. Ферменты в анализе
Специфичность взаимодействия фермента, субстрата и
эффектора (даже в составе сложных, в том числе биологических смесей) является основой аналитических применений ферментов в различных областях деятельности человека. Нам известно, как скорость реакции зависит от концентраций реагирующих веществ (см. раздел 3). Таким образом, при помощи построенных заранее калибровочных зависимостей возможно определение концентраций тех или
иных компонентов системы.
Так, зафиксировав концентрацию субстрата в реакционной среде и условия проведения эксперимента, такие, как
рН и температура, можно определять активность (концен-
трацию) фермента. В первую очередь такой анализ крайне
важен с диагностической точки зрения. Отклонение активности фермента в крови от нормальных
значений является
биохимическим указателем на потенциально протекающие
в организме патологические процессы (более подробно см.
раздел 5). Однако определение активности биокатализатора
является также абсолютно необходимым моментом при
проведении любых промышленных биотехнологических
процессов. В фармацевтической промышленности удельная
активность фермента является основной характеристикой
лекарственных ферментных препаратов.
При фиксировании условий проведения эксперимента и
исходной концентрации
фермента можно определять концентрацию субстрата в пробах. Например, концентрации
важнейших метаболитов в биологических жидкостях проводят именно таким образом. В качестве примеров можно
привести определение содержания глюкозы (глюкозооксидаза), пирувата (аланинаминотранфераза), лактата (лактатоксидаза), мочевины (уреаза) в крови и моче пациентов.
Для неинвазивного анализа концентраций метаболитов
98
предлагается их анализ в поте или конденсате выдыхаемой
жидкости.
Способ определения бактериальных загрязнений основан
на биолюминесцентной реакции окисления люциферина –
субстрата фермента люциферазы – в присутствии АТФ. В
ходе ферментативной реакции молекула продукта окисления переходит в возбужденную форму и возвращается в основное состояние с испусканием кванта света. Для трансформации одной
молекулы субстрата требуется одна молекула АТФ, таким образом, интенсивность люминесценции
пробы прямо пропорциональна концентрации АТФ. Сами
по себе эти пробы могут представлять собой образцы воды
из водоемов, жидкие продукты питания (молоко), смывы с
поверхностей оборудования пищевой промышленности или
медицинских учреждений и т. д. Их обрабатывают для достижения полного
лизиса бактериальных клеток, добавляют
фиксированные количества люциферазы и люциферина и
определяют концентрацию АТФ. Количество живых бактерий (колониеобразующих единиц, КОЕ) рассчитывают по
заранее построенной зависимости числа КОЕ от концентрации АТФ.
Если зафиксировать условия проведения эксперимента и
исходные концентрации фермента и субстрата, то в пробах
можно определять
концентрации обратимых ингибиторов
(см. раздел 3.2). К основным значимым для анализа обрати-
мым ингибиторам ферментов следует отнести ионы тяжелых металлов (экология, контроль качества продуктов питания), а также антибиотики. Широкое распространение антибиотиков в животноводстве и птицеводстве обуславливает риск их накопления в человеческом организме в ходе
потребления пищи. Существуют
предельно допустимые
нормы содержания антибиотиков в различных продуктах и
контроль их концентрации зачастую ведется при помощи
ферментов.
99
Определение остаточной активности фермента при его
инкубации с необратимым инактиватором (см. раздел 3.3)
довольно широко применяется в экологии и контроле качества продуктов питания при анализе содержания таких
групп веществ, как инсектициды, фунгициды и пестициды.
Как и антибиотики, эти вещества способны накапливаться в
организме человека, поступая туда по пищевой цепочке, зачастую
обладая при этом кумулятивным эффектом. В этой
связи контроль их содержания в продуктах питания является весьма важной задачей, обеспечивающей вопросы общей
безопасности человеческой жизни.
Ферментные «метки» используются также для качест-
венного и количественного выявления биоспецифических
взаимодействий при проведении гетерогенного иммуно- и
ДНК-анализа. Классическим примером иммуноферментной
аналитической методики является
так называемый сэндвичметод. Антитела фиксируются на некоторой поверхности
(обычно в лунках полистирольного планшета). После связывания антигена из пробы и последующей промывки в лунку
добавляют антитела к другому эпитопу того же антигена,
химически связанные (конъюгированные) с ферментом. Активность фермента в такой системе прямо пропорциональна
количеству образовавшихся тройных комплексов
, откуда и
рассчитывают концентрацию антигена в исходной пробе.
Чрезвычайно низкие пределы регистрации ферментов в растворе (известны усилительные каскадные системы, позволяющие регистрировать наличие всего лишь нескольких сотен молекул ферментов в 1 мл раствора) позволяют понижать
предел обнаружения антигена, то есть достоверно определять
минимальные концентрации вещества.
В одном из вариантов
определения ДНК в пробах используются два синтетических олигонуклеотида. Один (исходный) комплементарен определяемому участку ДНК и фиксирован в лунке планшета в известном количестве. Второй
также комплементарен первому, но содержит на своем кон-
100
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]