Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
5.2. Энзимодиагностика
Энзимодиагностика занимается изучением активности
ферментов в биологических средах с диагностической целью. В обычной медицинской и ветеринарной практике для
этого используют плазму или сыворотку крови. В специализированных клиниках такой анализ может проводиться в
лимфе, спинно-мозговой жидкости, тканях, и т. д.
Энзимопатологии связаны с недостаточной активностью
тех или иных
конкретных ферментов, и определение их активности крайне важно для назначения правильного лечения болезни. В норме же в крови человека присутствует
достаточно большое количество ферментов и в ходе различных заболеваний их активность может как повышаться,
так и понижаться.
Присутствующие в крови ферменты можно условно раз-
делить на две группы
– секреторные (функциональные) и
внутриклеточные (нефунциональные). К первой группе относятся ферменты, которые выполняют свои физиологические функции непосредственно в крови. К ним относятся,
например, ферменты регуляции сосудистого тонуса (ренинангиотензиновая и калликреин-кининовая системы), систем
свертывания крови, фибринолиза и комплемента. Такие
белки синтезируются в определенных органах (в большинстве своем
в печени) и секретируются в кровь. Ко второй
группе относятся белки, выполняющие свои функции исключительно внутри клеток тех или иных органов (в крови
их субстраты отсутствуют). В кровь они попадают в результате нормального клеточного обновления и их концентрация (активность) поддерживается на определенном уровне
балансом скоростей высвобождения из клеток
и выведения
из кровотока. Основной причиной повышения активности
нефункциональных ферментов в крови является повреждение клеток тех органов, где данные белки в основном локализованы. Таким образом, результаты биохимического ана-
141
лиза крови может указать на потенциальное развитие определенного заболевания.
В простейший биохимический анализ крови всегда вхо-
дит определение активности аланин
нотрансфераз
(АЛТ и АСТ, соответственно). Повышение
- и аспартатами-
их активности свидетельствует о протекании некоторых патологических процессов в печени, сердечной мышце, скелетной мускулатуре. Однако в разных органах эти ферменты присутствуют в разных количествах. Если АЛТ в основном локализована в печени, то АСТ – в сердечной мышце. В
этой связи помимо абсолютных
значений активностей данных ферментов используют еще и так называемых коэффициент де Ритиса – отношение активности АСТ к АЛТ. В
норме этот коэффициент составляет 0,91–1,75. Снижение
этого показателя (на фоне суммарного увеличения активности ферментов) говорит о проблемах с печенью, а повышение – о проблемах с сердцем. Снижение активности АЛТ
наблюдают при
инфекциях мочеполовой системы или де-
фиците пиридоксальфосфата в питании.
Активность щелочной фосфатазы возрастает при заболеваниях печени (желтухах) и разрушении костных тканей
(миеломная болезнь, старение организма).
Увеличение активности
-амилазы фиксируют при пери-
тонитах, панкреатитах (поджелудочная железа), сахарном
диабете, почечной недостаточности. Снижается ее активность при тиреотоксикозе, токсикозе беременных, инфаркте
миокарда.
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) является маркером поздней
диагностики инфаркта миокарда. Ее наличие позволяет отличить инфаркт от клинически сходного с ним приступа
стенокардии. Активность ЛДГ в крови возрастает также при
патологиях в работе печени, почек, а также при разрушении
мышечной ткани. Еще одним маркером инфаркта миокарда
является креатинфосфокиназа (КФК), также преимущественно локализованная в сердечной и скелетных мышцах.
142
Активность -глутамилтрансферазы (ГГТ) повышается
при заболеваниях печени и желчных протоков. ГГТ может
использоваться для выявления хронического употребления
алкоголя (ее уровень повышен у 75 % людей, страдающих
алкоголизмом).
Биохимические исследования никогда не выполняются
изолированно и зависят от предварительного диагноза. Так,
при панкреатите рекомендуют исследование уровней не
только ферментов поджелудочной железы – липазы, эластазы, панкреатической
амилазы, но и глюкозы и общего билирубина. Функции желчных протоков определяют по уровню
билирубина (общего, прямого и непрямого). Однако в расчет принимаются также желчные кислоты, альбумин, общий белок, а также активности АЛТ, АСТ, ГГТ, щелочной
фосфатазы и -амилазы.
Дополнительную информацию о заболевании можно по-
лучить при изучении
изоферментого состава определенного
фермента.
Изоферменты – это различные изоформы одного и того
же фермента, существующие в одном организме, но продуцируемые различными органами и, вследствие этого несколько различающиеся по своему составу. Все изоферменты одного и того же фермента выполняют одну и ту же каталитическую функцию, но могут значительно
различаться
по степени каталитической активности, по особенностям
регуляции или другим свойствам. Например, панкреатическая амилаза отличается по первичной структуре и свойствам от амилазы слюнных желёз, кишечника и других органов. Это послужило основой для разработки и применения
более надёжного метода диагностики острого панкреатита
путём определения не общей амилазы плазмы крови
, а
именно панкреатической изоамилазы.
Изоферменты четвертичной структуры состоят из нескольких субъединиц, которые обычно занимают эквивалентное (равноценное) положение в олигомере. При этом сами субъединицы, продуцируемые в различных органах, за-
143
частую отличаются друг от друга по молекулярной массе. В
этой связи олигомеры разного состава будут иметь различные массы. Их можно разделить методом электрофореза в
неденатурирующих условиях и измерить соотношение активностей полученных фракций. Именно соотношение концентраций (активностей) изоферментов является одним из
мощных факторов диагностики тех или иных заболеваний.
Так
, упомянутая выше креатинфосфокиназа (КФК) представляет собой димер, однако мономеры, вырабатываемые
мозгом (В-мономеры, от английского brain, мозг) отличаются от мономеров, экспрессирующихся в скелетных мышцах
(М-мономеры, от английского muscle, мышца). Образование
различных димеров приводит к существованию трех изоформ КФК: КФК-1 (ВВ), специфичной только для мозга;
КФК-2 (МВ), составляющей примерно
35 % общей активности КФК в сердечной мышце; КФК-3 (ММ), вырабатываемый сердечной и скелетными мышцами. В норме 100 %
активности КФК в крови приходится на долю КФК-3, однако повреждение сердечной мышцы в результате инфаркта
миокарда приводит к появлению в кровотоке КФК-2 (начиная с 3–6 ч после инфаркта и достигая максимума на 12–24
ч). Таким образом, наличие в крови изоформы КФК-2 на
фоне общего повышения активности фермента позволяет
отличить именно инфаркт от потенциальных патологий
скелетных мышц.
Аналогичная ситуация и в случае с лактатдегидрогеназой
(ЛДГ). ЛДГ функционирует в форме тетрамера, однако мономеры сердечной мышцы (Н-мономеры, от английского
heart, сердце), немного отличаются от мономеров
печени и
скелетных мышц (М-мономеры). В этой связи известно пять
изоформ ЛДГ – Н
ЛДГ
, ЛДГ4 и ЛДГ5 соответственно). В тканях с преимуще-
3
, Н3М, Н2М2, НМ3 и М4 (ЛДГ1, ЛДГ2,
4
ственно аэробным обменом веществ (сердце, мозг, почки)
наибольшей активностью обладают ЛДГ
и ЛДГ2. В тканях с
1
выраженным анаэробным обменом (печень, скелетные мышцы) преобладают ЛДГ
и ЛДГ5. Следовательно, при повреж-
4
144
дении какого-либо органа в крови будет повышаться доля
той изоформы, которая характерна для данного органа. Например, при инфаркте миокарда в крови повышается активность ЛДГ
и ЛДГ2, а при остром гепатите – ЛДГ4 и ЛДГ5.
1
5.3. Энзимотерапия
Энзимотерапия – направление, занимающееся использованием ферментов в качестве лекарственных средств. Ее традиционно разделяют на заместительную (использование
ферментов в случае их недостаточности) и комплексную
(применение ферментов в сочетании с другой терапией).
Заместительная терапия в основном используется при
недостатке пищеварительных ферментов. Причиной тому
могут служить как разные заболевания желудочнокишечного тракта
, так и уменьшение эффективности работы
поджелудочной железы с возрастом. Препараты на основе
пепсина, например, используют гипо- и анацидных гастритах. Возрастная недостаточность секреции пищеварительных соков компенсируется приемом комплексных препаратов, содержащих основные пищеварительных ферменты –
протеиназы для расщепления белков, амилазы для расщепления полисахаридов и липазы для гидролиза триглицеридов (
жиров и масел). Число фирменных названий таких
препаратов весьма велико, но в большинстве своем они готовятся на основе экстракта из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота – различия заключаются
только в соотношении активностей входящих в состав ферментов. Имеется также ряд препаратов на основе сока папайи, где высока
активность амилаз, но содержание липаз
незначительно. Эти же препараты показаны и здоровым
людям перед ситуациями, связанными с единичным обильным приемом пищи.
Протеолитические ферменты применяют для очистки раневых поверхностей и абсцессах легких. Эти ферменты эффективно расщепляют омертвевшие участки тканей, вязкие
145
секреты и экссудаты. По отношению к здоровым тканям
они безопасны в связи с наличием в них специфичных и неспецифичных ингибиторов. Чтобы увеличить (пролонгировать) время жизни фермента, изготовляют повязочные материалы с сорбированными на ткани белками. Медленная
десорбция белка на рану значительно увеличивает срок действия препарата. Трипсин и химотрипсин
выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого скота, террилитин
продуцируется плесневым грибом Аspergillus terriсоlа.
Коллагеназа расщепляет коллагеновые волокна, не входящие в состав коллагеновых фибрилл. В этой связи нормальная кожа не затрагивается, а «плохой» коллаген (шрамы, рубцы) подвергается распаду.
Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кислоту («це-
ментирующее» вещество соединительной
ткани), что повышает тканевую проницаемость, размягчает и уплощает
рубцы, предупреждает формирование контрактур. Препараты на основе гиалуронидазы применяют для рассасывания
рубцов после ожогов и операций.
Ряд антисептических средств для наружного и местного
применения (гели, кремы, антисептические жидкости, таблетки для рассасывания) изготавливаются на основе бакте-
риолитических ферментов
(лизинов) – ферментов, способ-
ных лизировать (разрушать) пептидогликан клеточной стенки бактерий. Полисахаридная часть пептидогликана представляет собой цепи муреина (полисахарид из строго чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и Nацетилмурамовой кислоты, соединенных -(1-4)-связью).
Карбоксильные группы остатков N-ацетилмурамовой кислоты образуют амидную связь с тетрапептидами одинакового строения, состав которых зависит от типа
бактерии. Трехмерная структура пептидогликана образуется за счет межпептидных мостиков, чаще всего между конечным (четвертым) аминокислотным остатком одного пептида и третьим
остатком другого. Эти остатки могут быть связаны между
собой непосредственно, либо через короткие пептиды. Таким
146
образом, пептидогликан представлен одной гигантской молекулой, предотвращающей осмотической шок бактерий. Ферментативный гидролиз тех или иных ковалентных связей
пептидогликана приводит к нарушению его прочности и, как
следствие, вызывает лизис бактерий. В этой связи к лизинам
относятся гидролазы различной специфичности – гликозидазы, амидазы, пептидазы. Наиболее широко известен куриный
лизоцим (мукопептид-N-ацилмурамоилгидролаза
), катализи-
рующий гидролиз 1,4--связей между остатками Nацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина в муреине. Амидазная активность (отщепление тетрапептидов от Nацетилмурамовой кислоты) присуща секретируемому бактериями Lysobacter sp. литическому комплексу белков (лизоа-
мидаза). Пептидазы, гидролизующие пептидные мостики, характерны для бактериофагов. Эти ферменты являются частью
жизненного цикла фагов и имеют узкую специфичность
по
отношению к пептидогликану бактерии-хозяина. В последние
два десятилетия они интенсивно изучаются и рассматриваются ныне как альтернатива традиционным антибиотикам, что
подчеркивается используемым для них в литературе термином «enzybiotics»
24
. Тем не менее, в настоящее время зареги-
стрирован только лизин Staphefect SA.100 – препараты на его
основе предлагаются лечения поверхностных дерматозов, вызванных S.aureus. Для профилактики вирусных заболеваний
предлагаются препараты на основе ДНК-азы.
Тромболитические препараты представляют собой активаторы плазминогена – находящегося в крови неактивного
предшественника плазмина, фермента, лизирующего тромбы. На практике
представлены препараты как бактериаль-
ного происхождения – на базе стрептокиназы и стафило-
киназы, так и рекомбинантные ферменты человека – тканевый активатор плазминогена, урокиназа и проурокиназа.
24
R.M.Danis-Wlodarczyk, D.J.Wozniak, S.T.Abedon. Treating bacterial infections
with bacteriophage-based enzybiotics: in vivo, in vitro and clinical applications. –
Antibiotics (Basel), 2021, v.10(12): 1497.
147
Препараты на основе аспарагиназы являются неотъемлемой частью комбинированной противоопухолевой терапии
лимфобластного лейкоза. Фермент катализирует гидролиз
L-аспарагина с образованием L-аспарагиновой кислоты. В
опухолевых клетках, в отличие от клеток нормальных тканей, отсутствует активность фермента аспарагинсинтетазы,
синтезирующей L-аспарагин из L-аспарагиновой кислоты.
При снижении концентрации аспарагина в крови нормальные клетки восполняют
его уровень за счет внутриклеточного синтеза, лейкозные клетки испытывают его недостаток,
что приводит к их гибели. Таким образом, аспарагиназа вызывает избирательную регрессию опухолевой ткани.
Рекомбинантные человеческие ферменты в ряде случаев
помогают поддерживать относительно нормальное состояние пациентов с наследственными энзимопатиями. Так,
препарат, содержащий рекомбинантную
-D-глюко-
цереброзидазу, применяется при лечении упоминавшейся
выше болезни Гоше (см. раздел 5.1). Болезнь Помпе (накопление гликогена в лизосомах, связанное с наследственной
недостаточностью
-1,4-глюкозидазы) также лечится пре-
паратом на основе рекомбинантного человеческого фермента. Следует отметить, что рекомбинантные ферменты весьма дороги. Так, годовой курс лечения болезни Помпе обходится от 100 до 300 тысяч долларов в зависимости от возраста и веса пациента.
Вопросы для самоконтроля
1. По каким принципам делят энзимопатологии на группы.
2. Приведите пример энзимопатологии липидного обмена.
3. Изоферменты и их роль в энзимодиагностике.
4. Приведите примеры ферментов-маркеров инфаркта
миокарда.
5. Какие ферменты используются для профилактики бак-
териальных заражений?
6. Механизм противоопухолевого действии аспарагиназы.
148
ПРИЛОЖЕНИЕ I
КЛЮЧ К НОМЕНКЛАТУРЕ ФЕРМЕНТОВ
(«Рекомендации Комитета по номенклатуре Междуна-
родного Союза по Биохимии и Молекулярной Биологии
(NC-IUBMB)», состояние на сентябрь 2024 г.,
http://www.enzyme-database.org)
1. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ.
1.1. Действуют на СН-ОН группу доноров.
1.1.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.1.2. Акцептором служит цитохром.
1.1.3. Акцептором служит кислород.
1.1.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.1.5. Акцептором служит хинон или родственное ему
соединение.
1.1.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.1.9. Акцептором служит медь-содержащий белок.
1.1.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.1.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.2. Действуют на альдегидную или кетонную группу
доноров.
1.2.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.2.2. Акцептором служит цитохром.
1.2.3. Акцептором служит кислород.
1.2.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.2.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.2.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.2.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.3. Действуют на СН-СН группу доноров.
1.3.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.3.2. Акцептором служит цитохром.
1.3.3. Акцептором служит кислород.
1.3.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.3.5. Акцептором служит хинон или родственное ему
соединение.
149
1.3.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.3.8. Акцептором служит флавин.
1.3.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.3.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.4. Действуют на СН-NН2 группу доноров.
1.4.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.4.2. Акцептором служит цитохром.
1.4.3. Акцептором служит кислород.
1.4.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.4.5. Акцептором служит хинон или родственное ему
соединение.
1.4.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.4.9. Акцептором служит медь-содержащий белок.
1.4.99. Используют другие, известные акцепторы.
1.5. Действуют на СН-NН группу доноров.
1.5.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.5.3. Акцептором служит кислород.
1.5.4. Акцептором служит дисульфидное соединение.
1.5.5. Акцептором служит хинон или родственное ему
соединение.
1.5.7. Акцептором служит железо-серный белок.
1.5.8. Акцептором служит флавин или флавопротеин.
1.5.98. Используют другие, известные акцепторы.
1.5.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.6. Действуют на NADH или NADPH.
1.6.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.6.2. Акцептором служит гемопротеин.
1.6.3. Акцептором служит кислород.
1.6.5. Акцептором служит хинон или родственное ему
соединение.
1.6.6. Акцептором служит азотистая группировка.
1.6.99. Используют неизвестные акцепторы.
1.7. Действуют на другие азотистые соединения в
качестве доноров.
1.7.1. Акцептором служит NAD+ или NADP+.
1.7.2. Акцептором служит цитохром.
150
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]