Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
3.15, А). Зная величину энтальпии Н и свободную энергию
T
k
G равновесного процесса при данной температуре (G = -
RTlnK), можно найти величину энтропии процесса:
GHS
(3.68)
Зависимость константы скорости химической реакции от
температуры в простейшем виде определяется полуэмпирическим уравнением Аррениуса. В современном виде это
уравнение записывается как:
E
a
RT
ekk
o
(3.69)
где k
– предэкспоненциальный множитель, а Еa – энергия
o
активации. Таким образом, в координатах lnk – 1/T зависимость представляет собой прямую линию с тангенсом угла
наклона –E
/R (рис. 3.15, Б).
a
tg = -Ea/R
tg = -H/R
lnK
А
1/T
ln
1/T
Б
Рис. 3.15. Температурная зависимость (А) константы равновесия в ко-
ординатах Вант-Гоффа и (Б) константы скорости реакции в координатах
Аррениуса
Зачастую уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса применяют к температурным зависимостям ферментативных реакций. Следует четко понимать, что в данном случае опреде-
81
ляемые величины констант являются эффективными и
представляют собой сложные комбинации констант индивидуальных стадий ферментативного процесса. Именно поэтому на широком температурном интервале подобные графики имеют четко наблюдаемые изломы. Объяснения такому поведению бывают разные – смена скоростьлимитирующей стадии, конформационный переход белковой глобулы в состояние с иной активностью и
т. д.
Таким образом, определяемые в координатах ВантГоффа и Аррениуса параметры не являются в чистом виде
термодинамическими величинами энтальпии или энергии
активации и более корректно говорить о температурном коэффициенте анализируемого параметра. В среднем скорость
ферментативной реакции возрастает в 2–4 раза при повышении температуры на 10 градусов.
Итак, с ростом
температуры абсолютные значения констант равновесия увеличиваются (рис. 16, А). Таким образом, рост температуры должен приводить к ухудшению, например, связывания фермента с субстратом. Кроме того,
сдвигаться в более кислый диапазон значений рН будут и
константы ионизации фермента, что приводит к сдвигу величины рН-оптимума ферментативной реакции в кислую
область
. Таким образом, при переходе к повышенным температурам следует в первую очередь определить рНзависимость активности фермента.
Увеличение кинетических констант с ростом температуры (рис. 3.15, Б) может неоднозначно сказываться на наблюдаемой кинетике ферментативных реакций. С одной
стороны, рост константы каталитической обуславливает
увеличение начальной скорости реакции. Однако одновременно с
этим увеличивается и скорость термической инактивации фермента за счет необратимого конформационного
«разворачивания» белковой глобулы (денатурации). В простейшем случае эту реакцию можно представить в виде
схемы мономолекулярной реакции:
82
(3.70)
где k
– константа скорости первого порядка. Именно нало-
in
жением двух разнонаправленных эффектов (возрастание
скорости ферментативной реакции и скорости инактивации
фермента с ростом температуры) обусловлено наличие так
называемого
«температурного оптимума» фермента. Прин-
цип определения температурного оптимума заключается в
том, что реакцию при фиксированных начальных концентрациях реагентов и одном и том же значении рН проводят в течение определенного времени при различных температурах,
после чего строится зависимость количества образовавшегося продукта за произвольно выбранное фиксированное время
([P]
). Быстрая инактивация фермента при повышенных
t=const
температурах приводит к остановке реакции (рис. 3.16, А), в
результате чего такие зависимости имеют колоколообразную
форму (рис. 3.17, Б). Температуру, при которой достигается
максимум величины [P]
, и называют температурным оп-
t=const
тимумом фермента. Как видно из рисунка 3.16, Б, эта величина весьма условна и зависит от времени проведения реакции – чем больше это время, тем ниже температура оптимума. Именно поэтому абсолютно неверным является часто
встречающееся в литературе утверждение, что температурный оптимум – это температура, при которой
являет максимальную активность.
фермент про-
Условность величины температурного оптимума связана
еще и с постоянным значением рН среды, в которой ведутся
эксперименты. Как говорилось выше, рост температуры
приводит к сдвигу рН-оптимума фермента в более кислую
область. В разделе 3.5 мы обсуждали, что рН-оптимум определяется оптимальным для катализа балансом заряженных и незаряженных групп белка – в этих условиях каталитически активная конформация белка наиболее устойчива к
83
тепловой денатурации. Таким образом, сдвиг рН-оптимума
с ростом температуры приводит к увеличению скорости его
инактивации. Тем не менее, при корректной постановке
экспериментов данные процессы можно изучать раздельно.
Рис. 3.16. Зависимость накопления продукта ферментативной реакции от
времени при различных температурах (А) и «температурный оптимум
фермента» при различных временах проведения процесса. Общий вид
3.7. Регуляция активности ферментов в живой природе
В природе для регуляции активности ферментов используются практически все рассмотренные в настоящем разделе случаи. Так, например, влияние концентрации субстрата
можно проиллюстрировать на примере потребления пищи.
Продолжительное голодание вызывает слабость и неприятные ощущения в желудке (пищеварительные ферменты
есть, но их природные субстраты отсутствуют). С другой
стороны, агрессивное переедание (слишком
высокие концентрации субстратов) «переводит» ферментативные процессы в режим «максимальной скорости» (нулевой порядок
реакции по субстрату). В итоге большая часть пищи остается непереваренной, что также приводит к неприятным последствиям (тяжесть в желудке, метеоризм, тошнота и т. д.).
К патологическим последствиям приводит и авитаминоз,
поскольку многие витамины являются
структурными эле-
84
ментами кофакторов, необходимых для успешного функционирования большого числа ферментов.
Влияние рН среды также можно увидеть на примере пищеварительных протеиназ, ферментов, расщепляющих белки до аминокислот. В кислой среде желудка начинает работать пепсин (рН-оптимум в районе 2,0). По мере перехода
пищи в кишечник и соответствующего увеличения рН активность
пепсина резко уменьшается и в процесс пищеварения включаются ферменты с рН-оптимумом в районе
нейтрального (трипсин, химотрипсин).
Другим примером контроля активности ферментов под
действием рН является карбоангидраза, катализирующая
обратимую реакцию разложения угольной кислоты на углекислый газ и воду:
В слабощелочной среде тканевых капилляров карбоангидраза сдвигает равновесие этой реакции в правую сторону, переводя образующийся в результате тканевого дыхания
углекислый газ в бикарбонат (протоны связываются гемоглобином). Бикарбонат-ионы доставляются в легкие, где, в
более кислых легочных капиллярах, карбоангидраза сдвигает равновесие в сторону образования углекислого газа, который затем и удаляется из организма.
Можно указать и на компенсаторные механизмы, связанные с увеличением активности ферментов при росте температуры. Так, мембранно-связанная Na,K-аденозинтрифосфатаза демонстрирует четкий перегиб на графике Аррениуса, который хорошо коррелирует с температурой плавления липидной мембраны. Таким образом, фазовый переход (плавление) липидной мембраны
приводит к изменению
конформации и резкому понижению температурного коэффициента фермента, что предотвращает его гиперактивность.
Важную роль в процессах регуляции активности фермен-
тов играют обратимые эффекторы. Так, протеинкиназа А
85
представляет собой гетероолигомер, состоящий их двух каталитических и двух регуляторных субъединиц, и не проявляющий ферментативной активности. цАМФ, связываясь с
регуляторными субъединицами белка, вызывает диссоциацию неактивного тетрамера с высвобождением каталитических субъединиц, включая тем самым процессы фосфорилирования белков. Поскольку диссоциация является обратимой реакцией, то после разрушения цАМФ
протеинкиназа А вновь собирается в исходный неактивный тетрамер и
фосфорилирование прекращается.
Регуляция ферментативной активности через образование или разрушение ковалентных связей может быть обратимой или необратимой. Необратимая ковалентная активация представляет собой появление активного фермента в
результате ограниченного протеолиза его неактивного
предшественника – зимогена. Активный центр в зимогене
стерически
закрыт для доступа субстрата концевым полипептидом или некоторой петлей аминокислотной последовательности белка. Гидролиз пептидной связи между двумя
конкретными аминокислотами приводит к появлению фермента в его активной форме. Так, для образования активного
трипсина, протеиназы желудочно-кишечного тракта, требуется отщепление гексапептида Val-(Asp)
-Lys с N-конца
4
трипсиногена (реакция происходит под действием энтеропептидазы, возможен также автокаталитический механизм
активации трипсиногена самим трипсином). В то же время
плазмин образуется при расщеплении активаторами плазминогена связи Arg561-Val562 и превращением одноцепочечного плазминогена в двухцепочечный активный фермент.
Классическим примером обратимой ковалентной регуляции являются реакции фосфорилирования-дефосфорилирования белков.
Активная гликогенсинтаза переводится в
неактивное состояние фосфорилированием серина активного центра фермента (процесс осуществляет киназа гликогенсинтазы 3). Обратная реакция (активация гликогенсинтазы дефосфорилированием активного центра) катализирует-
86
ся протеинфосфатазой 1. В то же время гликогенфосфорилаза активна в фосфорилированной форме (тетрамер) и гораздо менее активна в димерной дефосфорилированной
форме, что связано с конформационными изменениями
фермента в ходе ковалентной модификации. Упаковка дефосфорилированных субъединиц такова, что двадцатичленный полипептид на N-конце молекулы заглублен в белковую глобулу за счет
электростатических взаимодействий
между положительно заряженными остатками полипептида
и отрицательно заряженными остатками глобулы. В этом
состоянии активный центр фермента довольно сильно искажен. Фосфорилирование Ser14 под действием киназы
фосфорилазы нарушает это взаимодействие и «выталкивает» N-концевой домен из кислой области белка. Отрицательно заряженная фосфатная группа в свою очередь электростатически взаимодействует
с боковыми цепями нескольких остатков аргинина, что приводит к тетрамеризации белка и повышению его активности.
Довольно часто приводимый пример кинетической стабилизации ферментативной активности в живой природе –
так называемый механизм обратной петли (обратной связи). Если мы имеем цепь последовательных реакций, то
скорость накопления продукта конечной стадии будет ли
-
митироваться скоростью самой медленной (скоростьлимитирующей) стадии в цепи (для простоты примем, что
это самая первая стадия процесса).
Механизм обратной связи заключается в том, что конечный продукт последовательной реакции является ингибитором скорость-лимитирующей стадии. В этом случае возможные ускорения суммарного процесса будут тормозиться
ингибирующим действием конечного продукта
на самую
медленную стадию реакции и снижать тем самым эффективность работы всей цепи.
Образование белковых гетероолигомеров также способствует в ряде случаев изменению каталитических свойств
ферментов. Плазмин (Пл) – фермент, расщепляющий фиб-
87
риновые сгустки (тромбы) в кровотоке – вырабатывается в
виде зимогена и не способен к автоактивации. Активация
плазминогена (Пг) происходит под действием специфических протеиназ (Акт). В случае прямых активаторов (урокиназа, тканевый активатор плазминогена) реакция протекает по классической трехстадийной схеме:
В случае же активаторов непрямого действия (стафилокиназа, стрептокиназа) димеры активатор/плазмин довольно
устойчивы и способны к каталитической активации плазминогена в плазмин. Более того, в случае стрептокиназы плазминоген активируется даже комплексом стрептокиназа/плазминоген!
11
Механизм быстрого повышения ферментативной активности в локальной области организма основан на каскадных
ферментативных реакциях, примером которых является реакция тромбообразования. Тромбы образуются в результате
ограниченного протеолиза фибриногена в фибрин-мономер
ферментом тромбином. Далее фибрин-мономер полимеризуется, захватывает в свою сетку форменные элементы крови, и
образует «пробку», предотвращающую кровопотерю.
Самопроизвольное тромбообразование при этом имеет очень негативные последствия для организма, поэтому в крови тромбин присутствует в виде неактивного зимогена – протромбина, а большое количество белковых ингибиторов тромбина
(антитромбины) связывает спонтанно активированный тромбин в неактивные комплексы. При повреждении внешних
тканей из поврежденных клеток выделяется тканевый тромбопластин,
который «запускает» последовательный каскад
11
Р. Б. Айсина, Л. И. Мухаметова, Д. А. Гулин, К. Б. Гершкович, С. Д.
Варфоломеев. Стрептокиназа и стафилокиназа: различия кинетики и
механизма взаимодействия с плазминогеном, ингибиторами и фибрином. – Биоорг. химия, 2015, Т.41, № 5, с. 565–578.
88
активации зимогенов – VII-го и X-го факторов свертывания
крови; активный Х-тый фактор и активирует протромбин.
Концентрация продукта ферментативной реакции прямо
пропорциональна времени. Однако если этим продуктом
является другой фермент, то концентрация продукта второй
реакции будет пропорциональна уже квадрату времени. В
общем случае накопление конечного продукта ферментативного каскада будет пропорциональна времени
в степени
n, где n – число стадий процесса. Таким образом, использо-
вание каскадного механизма активации протромбина позволяет быстро создать высокие концентрации тромбина (превышающие емкость антитромбинов в крови) в области повреждения ткани и сформировать защитный тромб.
Вопросы для самоконтроля
1. Каковы физический смысл и размерность параметров
уравнения Михаэлиса-Ментен.
2. Какие способы расчета параметров уравнения Миха-
элиса-Ментен вы знаете?
3. К какому типу ингибирования можно отнести ингиби-
рование фермента избытком субстрата?
4. Как отличить необратимый ингибитор от обратимого?
5. Как определить кинетические параметры фермента-
тивной реакции в условиях переменной концентрации субстрата?
6. Опишите схему эксперимента для нахождения темпе-
ратурного оптимума фермента.
4. ПРОМЫШЛЕННАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ
Сам термин «энзимология» появился в середине XIX века в результате дискуссии микробиологов и химиков о природе спиртового брожения – одного из первых биотехнологических процессов, используемых человечеством. Микробиологи (в первую очередь под давлением авторитета Л.
Пастера) считали, что образующийся спирт является про-
89
дуктом жизнедеятельности некоторых живых организмов,
который они называли «fermentum», то есть «закваска»
(лат.). Химики отстаивали точку зрения о том, что внутри
клеток имеются конкретные вещества белковой природы,
ответственные за протекание данного процесса. В 1867 году
В. Кюн предложил для этих веществ название «энзим»,
скомбинировав греческие «en» («в») и «zyme» («закваска»).
В
конце XIX в. Э. Бухнер подтвердил справедливость мнения ученых-химиков, показав возможность сбраживания
сахара бесклеточными экстрактами дрожжей (Нобелевская
премия по химии 1907 г. «за биохимические исследования
внеклеточной ферментации и выделение зимазы»).
Успехи микробиологии и генной инженерии позволяют в
настоящее время получать рекомбинантные ферменты требуемой специфичности в больших количествах и использовать
их в промышленных масштабах. В первую очередь
ферменты востребованы в пищевой промышленности. Огромную нишу занимают и ферментные препараты для производства так называемых «умных» стиральных порошков.
Природные биокатализаторы активно применяются в косметической, целлюлозо-бумажной, текстильной и кожевенной промышленности. Некоторые отрасли животноводства
(например, свиноводство и птицеводство) широко исполь
зуют ферментные препараты для повышения усвояемости
кормов. Реакции тонкого органического и энантиоселективного синтеза весьма востребованы при получении лекарственных препаратов. Отдельно следует упомянуть аналитические возможности ферментов как для определения концентраций тех или иных веществ, так и в качестве меток
при проведении различных биоаналитических процедур.
4.1. Липазы в промышленных технологиях
Пищевая биотехнология с использованием целых клеток
позволяет получать продукты с богатыми вкусовыми качествами в силу большого количества различных веществ, произ-
-
90
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]