Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
образуются промежуточные соединения, которые претерпевает последовательные превращения вплоть до образования
конечных продуктов реакции и регенерации активного фермента. Именно с этой работы и отсчитывают историю фер-
4
ментативной кинетики
. Действительно, в простейшем случае
описание ферментативных реакций укладывается в рамки так
называемой двухстадийной схемы:
(3.1)
Леонор Михаэлис (1875–1949 гг.) Мод Ментен (1879–1960 гг.)
В схеме (3.1) [Е] – фермент, [S] – субстрат, K
– констан-
S
та диссоциации фермент-субстратного комплекса [ES]
]S][E[
K
S
]ES[
(3.2)
Рассмотрим кинетику данной реакции при условии [S]
>> [E]o (что является обычным условием для проведения
ферментативных реакций) и примем, что равновесие на ста-
o
4
K. A. Johnson. A century of enzyme kinetic analysis, 1913 to 2013. – FEBS
Lett., 2013, V.587, P.2753–2766.
41
дии образования фермент-субстратного комплекса в реакции (3.1) устанавливается намного быстрее, чем протекает
сама реакция. В этом случае скорость образования продукта
реакции Р равна:
v
d
dt
k
[ES]
2
,
(3.3)
][P
где k
– константа скорости первого порядка для реакции
2
продуктивного распада фермент-субстратного комплекса, а
уравнение материального баланса по ферменту выглядит
как:
[E]
= [E] + [ES] (3.4)
o
Выражая [E] через [ES] из уравнения (3.2) и подставляя
эту величину в уравнение (3.4), при помощи небольших
преобразований можно выразить [ES] через [E]
, [S] и KS.
o
Подставляя далее полученную величину в уравнение (3.3),
получаем:
[S][E]
k
o
2
v
K
S
]S[
(3.5)
При изучении начальных скоростей реакций, когда расходом субстрата можно пренебречь (то есть [S] [S]
), име-
o
ем:
[S][E]
k
2
v
K
S
Бриггс и Холдэйн
oo
]S[
o
5
проанализировали схему (3.1) с точки
(3.6)
зрения принципа стационарных концентраций, когда равно-
5
G. E. Briggs, J. B. Haldane. A note on the kinetics of enzyme action. –
Biochem J., 1925, V.19, P. 338–339
42
весие при образовании фермент-субстратного комплекса не
достигается:
E+S
k
1
k
-1
ES
k
2
E+P
(3.7)
Скорость накопления продукта реакции определяется
уравнением (3.3.). Постоянство этой скорости (рис. 3.1, А)
означает, что концентрация промежуточного продукта также
ES не меняется во времени, то есть:
d
[ES]
dt
kkk
211
0])[ES([E][S]
(3.8)
Выразив [E] через [ES] из уравнения (3.8), подставив эту
величину в уравнение (3.4) и проводя далее преобразования,
аналогичные рассмотренному выше случаю, получаем:
[S][E]
k
2
v
K
m
oo
]S[
o
(3.9)
где K
= (k-1 + k2)/k1 – сложная величина, названная автора-
m
ми константой Михаэлиса. Видно, что уравнение (3.5)
представляет собой частный случай уравнения (3.9), когда
k
>> k2, и, следовательно, Km = KS = k-1/k1.
-1
Рассмотрим более сложную схему ферментативной реакции с участием двух промежуточных соединений, равновесной первой стадией и образованием двух продуктов реакции на различных стадиях (такая трехстадийная схема
описывает механизм катализа многих ферментов):
(3.10)
43
В этом случае стационарная скорость образования продукта Р
равна:
2
]P[
d
2
dt
k
]'ES[
3
(3.11)
Условием стационарности скорости реакции является
уравнение:
]'ES[
d
dt
32
,
0]'ES[]ES[
kk
(3.12)
откуда:
k
2
k
3
]'ES[]ES[
(3.13)
Из выражения для константы диссоциации ферментсубстратного комплекса ES с учетом уравнения (3.13) следует:
k
]E[
[ES]
KK
[S]
][ES'
3
SS
[S]
k
2
(3.14)
Подставляем величины [E] и [ES] из уравнений (3.13–
3.14) в уравнение материального баланса по ферменту:
= [E] + [ES] + [ES’] (3.15)
[E]
o
выражаем [ES’] через начальную концентрацию фермента
[E]
и подставляем эту величину в уравнение (3.11). При
o
учете условия [S] [S]
получаем:
o
44
k
v
[S][E]
ooкат
,
]S[
K
m
o
(3.16)
где
k
кат
kk
32
, а
kk
32
k
3
KK
Sm
kk
32
(3.17)
При наличии первоначальной обратимой стадии для
ферментативной реакции с любой схемой зависимость стационарной скорости реакции от концентраций фермента и
субстрата (при условии [S] [S]
уравнения (3.16), где параметры k
) будет иметь общий вид
o
и Km представляют со-
кат
бой комбинации констант индивидуальных стадий процесса
и могут включать в себя концентрации других веществ, так
или иначе взаимодействующих с ферментом (см. разделы
3.2 и 3.5).
Равенство (3.16) представляет собой дифференциальную
форму уравнения Михаэлиса-Ментен. Согласно этому уравнению, стационарная скорость ферментативной реакции
имеет первый порядок по ферменту. По субстрату порядок
реакции
низких концентрациях субстрата ([S]
зависит от его концентрации. Действительно, при
<< Km) уравнение
o
(3.16) трансформируется к виду уравнения простой бимолекулярной реакции:
k
кат
v
K
[S]E][
m
oo
где реакция имеет первый порядок по субстрату. При высоких концентрациях субстрата ([S]
определяется уравнением v = k
>> Km) скорость реакции
o
[E]o = V
кат
и кажущийся
max
порядок реакции по субстрату является нулевым. Следовательно, в промежуточном интервале концентраций порядок
реакции по субстрату промежуточный между первым и ну-
45
левым и зависит от соотношения [S]o/Km.
x
x
Каталитическая константа k
имеет размерность кон-
кат
станты скорости первого порядка (обратное время), ее физический смысл – количество молекул субстрата, трансформируемых одной молекулой фермента в единицу времени. Произведение k
называют максимальной скоростью реакции V
[E]o, имеющее размерность скорости,
кат
, достигае-
max
мой в условиях избытка субстрата по сравнению с величиной константы Михаэлиса. Константа Михаэлиса
имеет
размерность концентрации. Ее физический смысл – концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине от максимальной. Отношение k
, имеющее раз-
кат/Km
мерность константы скорости второго порядка, называют
константой эффективности ферментативной реакции.
Прямое определение параметров уравнения МихаэлисаМентен (3.16) из набора данных ([S]
o,1-vo,1
, [S]
o,2-vo,2
…) воз-
можно проводить методом нелинейной регрессии. Однако
на практике для этого используют линейные анаморфозы
данного уравнения. Наиболее часто применяемый метод –
предложенное в 1934 г. представление уравнения (3.16) в
двойных обратных координатах 1/v – 1/[S]
Лайнуивера-Берка
6
). Как видно из выражения:
(координаты
o
K
111
m
ma
V
Vv
S][
oma
(3.18)
график зависимости (3.16) в координатах Лайнуивера-Берка
является прямой, пересекающей оси ординат и абсцисс в
точках 1/V
и –1/Km соответственно (рис. 3.2, А).
max
При домножении правой и левой частей уравнения (3.18)
на [S]
получают уравнение:
o
K
o
v
6
H. Lineweaver, D. Burk. The determination of enzyme dissociation con-
stants. – J.Am.Chem.Soc., 1934, V.56, P. 658–666.
max
S][S][
m
o
VV
max
(3.19)
46
1/v
a
o
А
-1/K
m
[S]o/v
Km/V
-K
m
v
o
V
max
tg = - K
max
tg = Km/V
1/V
max
1/[S]
o
o
tg = 1/V
[S]
o
В
m
V
max/Km
m
Б
max
vo/[S]
o
Рис. 3.2. Определение параметров уравнения Михаэлиса-Ментен в координатах
Лайнуивера-Берка (А), Вульфа-Хейнса (Б) и Иди-Хофсти (В).
Координаты [S]
/v – [S]o имеют название координат Вуль-
o
фа-Хейнса и отрезки, отсекаемые в этих координатах экспе-
риментальной прямой на осях ординат и абсцисс, равны
K
m/Vmax
и -Km, соответственно (рис. 3.2, Б).
Третья из относительно широко применяемых анаморфоз
носит название уравнения Иди-Хофсти:
47
v
KVv
mmax
S][
o
(3.20)
В этом случае графическое построение экспериментальных данных в координатах v – v/[S]
пересечения ординат, равной V
на, равным –K
(рис. 3.2., В). Существуют и другие способы
m
дает прямую с точкой
o
, и тангенсом угла накло-
max
трансформации уравнения Михаэлиса в линейную функцию, однако они не имеют широкого применения.
Три вышеописанные линейные анаморфозы уравнения
(3.16) традиционно приводятся в учебниках по биохимии.
Однако с точки зрения кинетика-практика лучше использовать координаты Лайнуивера-Берка. Дело в том, что любая
величина в уравнении
(3.16) определяется с некоторой
ошибкой измерения, зависящей от точности используемого
прибора. Даже задаваемые в эксперименте начальные концентрации веществ зависят от точности весов и дозаторов.
В этой связи применяемые в координатах Вульфа-Хейнса и
Иди-Хофсти параметры [S]
/v и v/[S]o дают (с точки зрения
o
математической статистики) гораздо большую ошибку при
построении графика, чем каждая из этих величин в отдельности. Координаты Иди-Хофсти, вообще неприменимы для
анализа кинетических данных. При получении графика какой-то линейной функции необходимо задавать значения
аргумента (ось «х» координат) такими, чтобы они находились на
равном расстоянии друг от друга. Координаты Иди-
Хофсти такой возможности не дают.
Как уже говорилось выше, порядок ферментативной реакции по субстрату имеет промежуточный (между первым и
нулевым) порядок. В этой связи экспериментальное определение величины K
диапазоне концентраций субстрата 0,1 K
возможно только в относительно узком
m
<< [S]o << 10 Km.
m
Из экспериментальных данных по зависимости скорости
ферментативной реакции от концентрации субстрата возможно определить только величину максимальной скорости
48
реакции V
K
β
. Определение точного значения величины ка-
max
талитической константы требует проведения отдельного
эксперимента по титрованию истинной концентрации активных центров фермента в используемом препарате (см.
раздел 3.3). Если же такое титрование провести невозможно, рекомендуется использовать международные единицы
активности – количество фермента, трансформирующего
1 мкМ субстрата в мин при фиксированных значениях температуры и рН
среды.
3.2. Влияние обратимых эффекторов на скорость
ферментативной реакции
Обратимо действующий на фермент эффектор (вещество,
способное обратимо связываться с ферментом и/или фермент-субстратным комплексом и влиять на кинетические
характеристики ферментативной реакции) является мощным механизмом регуляции ферментативной активности в
живых организмах. Если полагать, что стехиометрия реакции фермент-эффектор составляет 1:1, то общая кинетическая схема трансформации субстрата
в присутствии эффектора (исходя из базовой двухстадийной схемы (3.1)) будет
выглядеть следующим образом:
k
2
E+P
α
Э
k
2
EЭ +P
(3.21)
+ Э
E+S
K
Э
EЭ +S
S
+ Э
αK
ES
EЭS
S
Анализ кинетической схемы (3.21) в условиях [S]
>> [E]
приводит к следующему выражению для стационар-
о
, [Э]о
о
ной скорости ферментативной реакции:
49
K
k
кат
K
v
K
K
S
K
oЭ
[S]E][
Э][
oЭ
Э][
oЭ
Э][
oЭ
oo
,
S][
o
(3.22)
Э][
где
Э][
K
oЭ
kk
каткажкат,
K
Э][
oЭ
(3.23)
и
Э][
K
oЭ
KK
Sкажm,
K
Э][
oЭ
(3.24)
Нижний индекс «каж» указывает на то, что определяемые в эксперименте величины констант каталитической и
Михаэлиса зависят от концентрации эффектора в реакционной смеси. Разделение эффекторы на типы строится исключительно на их влиянии на наблюдаемые величины кинетических параметров k
и Кm, как по отдельности, так и вме-
кат
сте. Практическое определение констант связывания эффектора с ферментом проводят анализом k
кат,каж
и К
m,каж
, полу-
ченных из зависимостей скорости реакции от концентрации
субстрата при фиксированных концентрациях эффектора.
Необходимо подчеркнуть, что в данном разделе мы будем
рассматривать именно кинетические типы действия обратимых эффекторов безотносительно реально имеющихся взаимодействий этих веществ с теми или иными участками белковой глобулы. Дело в том, что уравнение Михаэлиса-
Ментен
является достаточно универсальным и описывает процессы,
протекающие по более сложным схемам, чем кинетическая
схема (3.21). Иными словами, физический смысл входящих в
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]