Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
вильно классифицировать эти ферменты как лиазы (например, триптофан-синтаза ЕС 4.2.1.20 или цистатионин-синтаза ЕС 4.2.1.22). Введение в 2018 г. седьмого класса
ферментов также произошло именно потому, что известные
на тот момент времени механизмы ферментативных реакций не могли объяснить тип катализа, присущий данным
биокатализаторам.
1.3. Строение ферментов
Ферменты представляют собой высокомолекулярные соединения, состоящие из цепочек -L-аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями.
Традиционно говорят о 20 канонических протеиногенных
аминокислотах (авторских взгляд на эту проблему изложен
в Приложении 2), что и определяет огромную вариабельность аминокислотных последовательностей (порядок расположения аминокислотных остатков в полипептидных цепях от N- к С-концу). Например
, для цепи длиной в 100
аминокислот возможное число белков с различающейся
структурой равно 20
100
. Однако специфичность и эффективность белков обусловлена также различными формами
(уровнями) их структурной организации.
Выделяют первичную структуру белка, обусловленную
ковалентными связями. В данном случае имеются в виду не
только пептидные связи, соединяющие соседние аминокислоты, но и дисульфидные связи (мостики), соединяющие
атомы серы двух остатков цистеина.
Вторичная структура белка определяется специфиче-
ской укладкой локальных участков полипептидной цепи в
пространстве. Основные элементы такого типа – -спирали
и -складчатые листы. В -спиралях пептидная цепь изгибается винтообразно и стабилизируется водородными связями между амидным атомом водорода и карбонильным
атомом кислорода четвертого по счету аминокислотного
11
остатка. Складчатые слои (-листы) образуются из распо-
ложенных рядом друг с другом растянутых (неспиральных)
участков полипептидных цепей, причем плоскости пептидных связей расположены в пространстве подобно равномерным складкам листа бумаги. Такие структуры стабилизированы межмолекулярными водородными связями и называются антипараллельными, если цепи ориентированы в
противоположных направлениях, и параллельными, если
цепи ориентированы в одном направлении. Важную роль
здесь играют -изгибы, которые направляют полипептидную цепь в требуемом направлении для образования структур и обуславливают взаиморасположение -спиралей
и -листов при образовании третичной структуры.
Третичная структура белка образуется при сворачивании
полипептидной цепи в компактную трехмерную систему.
Амфифильность аминокислотной
цепи (наличие аминокислот с гидрофобными и гидрофильными боковыми остатками)
приводит к тому, что как можно больше гидрофобных остатков «стараются» быть экранированными от термодинамически невыгодного контакта с водной средой. На поверхности
же в основном располагаются гидрофильные аминокислотные остатки. В целом такая трехмерная структура стабилизируется четырьмя типами взаимодействий – водородные связи
между пептидными группами, водородные связи между боковыми радикалами, ионные связи и гидрофобные взаимодействия. Дисульфидные мостики также принимают активное участие в стабилизации трехмерной структуры белков.
Фолдинг (сворачивание) белковой глобулы фермента приводит к тому, что удаленные друг от друга в аминокислотной
последовательности остатки становятся сближены между собой в пространстве и формируют активный центр биокатализатора. Он состоит из двух подцентров (доменов) – суб-
страт-связывающего (сорбционного), который отвечает за
образование фермент-субстратного комплекса и правильную ориентацию молекулы субстрата в активном центре, и
12
каталитического, который, собственно, и производит акт
необходимой трансформации субстрата. Таким образом,
одну полипептидную цепь можно рассматривать как один
или несколько функциональных доменов, каждый из которых включает в себя один или несколько структурных доменов. В настоящее время нестрогое определение домена
включает в себя самостабилизацию и независимую от остальной части
белковой цепи укладку. Их также рассматривают как «единицы» сворачивания, поскольку они могут
подвергаться фолдингу независимо друг от друга.
Следует подчеркнуть, что в нормальных условиях полипептидная цепь не свертывается произвольно с образованием
статистического (хаотичного) клубка. Согласно термодинамике, для определенной пептидной последовательности существует лишь ограниченное число состояний, когда свободная энергия как функция пространственного строения (то
есть функция нековалентных взаимодействий между остатками полипептидной цепи) обнаруживает минимум. Иными
словами, первичная последовательность аминокислотных
остатков «кодирует» набор строго определенных типов вторичной, доменной и третичной структур белка.
Четвертичной структурой называют белковые олигомеры (комплексы), состоящие из нескольких ковалентно друг с
другом не связанных белковых глобул. Субъединицы, образующие олигомер, могут быть гомогенными (одинаковыми
по составу) или гетерогенными (различными по составу и
массе). Четвертичная структура поддерживается ионными,
водородными и гидрофобными взаимодействиями. Это означает, что субъединицы могут существовать и в мономерном
состоянии, однако эффективность их действия в составе олигомера гораздо выше.
Следует иметь в виду тот факт, что после фолдинга белковой глобулы ее переход в функционально активную форму зачастую происходит в результате ограниченного протеолиза – гидролиза определенных пептидных связей в аминокислотной последовательности. Такой механизм характе-
13
рен, например, для протеолитических ферментов, которые
синтезируются клеткой в виде проферментов – зимогенов.
Однако этот процесс не приводит к переходу белка на уровень четвертичной структуры, даже несмотря на возникновение нескольких фрагментов полипептидной цепочки, поскольку все эти фрагменты соединены между собой ковалентными дисульфидными связями.
Особый интерес для энзимологии
представляют полиферментные системы, так называемые «молекулярные конвейеры» – совокупность ферментов, организованных во
времени и пространстве, катализирующих некоторые последовательные (или последовательно-параллельные) реакции превращения метаболитов, связанные друг с другом отношениями субстрат – продукт. Классическими примерами
полиферментных систем являются пируватдегидрогеназный
комплекс и комплексы электрон-транспортной цепи, локализованные на внутренней мембране митохондрий, и осуществляющие перенос электронов от интермедиатов цикла
Кребса к кислороду.
1.4. Небелковые компоненты ферментов
Для осуществления катализа ферментам необходимо
участие вспомогательных соединений – кофакторов. В этой
роли могут выступать как органические вещества относительно сложного строения, так и неорганические комплексы
или ионы. Кофакторы разделяют на простетические группы
и коферменты.
Простетическая группа по сути своей является каталитическим центром фермента. Она координирована с белковой частью (апоферментом) ковалентно или при участии
ряда слабых взаимодействий (образованный комплекс называют холоферментом) и осуществляет весь каталитический цикл, не покидая молекулы холофермента.
Классическими органическими простетическими группами являются флавины – рибофлавин-5’-фосфат (флавин-
14
мононуклеотид, ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД),
катализирующие окислительно-восстановительные реакции.
Эти соединения образуют холофермент за счет слабых
взаимодействий. Липоевая кислота (липоамид, катализ декарбоксилирования 2-кетокислот) присоединена к белку через ковалентную связь со свободной аминогруппой лизина.
С использованием аналогичной ковалентной связи формируются и пиридоксаль-зависимые ферменты различной специфичности – рацемазы, трансаминазы, декарбоксилазы.
Простетические группы в виде ионов переходных металлов широко распространены среди ферментов. Комплексообразование этих ионов с белком происходит в основном за
счет координационных взаимодействий с образованием
термодинамически устойчивых аддуктов. Такие биокатализаторы называют металлоферментами. Наибольшее количество металлооксидоредуктаз содержат в активном центре
Fe, как в виде собственно ионов, так
и в виде железосерных
кластеров различной стехиометрии. Для катализа окислительно-восстановительных реакций ферменты используют
также V, Mn. Co, Ni, Cu, W, Se. Перенос групп осуществляется при помощи Fe, V, Co, Ni, Cu, Mo, W. Ионы Zn, Ni, Mn
участвуют в гидролизе, а за транспорт электронов отвечают
Fe, Co, Mo.
Промежуточное место между чисто органическими и неорганическими простетическими группами занимают производные тетрапирролов с координированным ионом переходного металла – гемы (Fe и порфириновое кольцо) и кобаламины (Co и корриновое кольцо). Гем-содержащие белки с окислительно-восста-новительными функциями называют цитохромами, а кобаламины являются простетическими группами метилтрансфераз.
Кофермент вступает в более сложные взаимодействия,
будучи связующим звеном между двумя ферментами и
обеспечивая их функционирование в качестве единой ферментативной системы. В рамках протекания одной ферментативной реакции кофермент можно рассматривать в каче-
15
стве второго субстрата, который регенерируется в ходе другой (сопряженной) реакции. Коферменты в основном участвуют в реакциях переноса. Так, переносчиками фосфатной
группы в процессах трансфосфорилирования служат различные нуклеозиды и нуклеотиды (наиболее известен аденозиндифосфат, АДФ). В качестве переносчиков водорода
наиболее широко распространены в природе никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинукле
отид-фосфат (НАДФ), Важную роль в промежуточном обмене жиров играет переносчик ацильных групп кофермент
А (3’-фосфо-АДФ-пантоил--аланилцистеамин, СоА).
Следует отметить, что введение седьмого класса ферментов в классификацию ферментов заставляет пересмотреть
традиционное деление кофакторов на простетические группы и коферменты. Для функционирования транслоказ (все
транслоказы представляют собой мембранно-связанные
белки) наличие липидной мембраны является необходимым
условием. По всей видимости, в ближайшее время следует
ожидать определенных изменений и в традиционной биохимической классификации кофакторов.
С точки зрения биотехнологического применения ферментов следует отметить также роль таких ионов металлов, выполняющих структурные функции. Комплексообразование с
такими ионами (чаще всего Ca) не влияют впрямую на эффективность катализа, но существенно повышают устойчивость активной конформации белка к неблагоприятным
внешним воздействиям. Посттрансляционное гликозилирование также заметно повышает стабильность ферментов, а в ряде случаев может влиять и на его кинетические свойства. Таким образом, не стоит ограничивать набор небелковых компонентов ферментов исключительно рамками кофакторов.
Вопросы для самоконтроля
1. Дайте определение фермента.
2. Чем определяется специфичность действия ферментов?
3. Перечислите классы ферментов.
16
-
4. Что означает четвертое число в кодовом номере фермента?
5. Назовите уровни структурной организации белка.
6. Что такое «зимоген»?
7. В чем отличие простетической группы от кофермента?
2. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ФИЗИКОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ФЕРМЕНТОВ
2.1. Предобработка биологического материала
Для определения физико-химических характеристик белков в целом, и ферментов в частности, необходимо получить их в виде индивидуальных веществ. Процедура выделения начинается с перевода белков в растворенное состояние, например, разрушение клеток и отделение клеточного
дебриса (для микроорганизмов) или гомогенизация образца
и экстракция (для организмов, органов и тканей). В зависимости от свойств целевого фермента для его максимальной
экстракции применяют буферные растворы различной природы, концентрации и величиной рН, нередко с добавлением детергентов.
Предварительное фракционирование полученных белковых смесей применяется для грубого отделения ненужных примесей. Например, в концентрированных растворах
солей растворимость белков обратно зависит от их молекулярной массы. Ступенчатое повышение концентрации
сульфата аммония (высаливание) позволяет перевести в
осадок вначале высокомолекулярные белковые фракции, а
затем промежуточные. При этом после удаления соли осадок перерастворяется с сохранением белками своих физикохимических свойств и биологической активности.
На растворимость белков также влияют рН, температура
и содержание органического растворителя. Именно на варь-
17
ировании этих параметров основан метод фракционирования белков плазмы крови по Кону.
Ультрафильтрация – мембранный процесс разделения
веществ, основанный на фильтровании раствора под давлением через мембрану с определенным диаметром пор. Белковые молекулы с размерами глобулы, меньшими, чем диаметр пор, проходят с раствором через мембрану, высокомолекулярная фракция остается над
ней. Преимущество ультрафильтрации заключается в том, что все белки остаются в
водной фазе (не требуется перерастворения осадков), недостаток – относительно долгое время проведения процедуры.
Методы предварительного фракционирования достаточно просты, легко масштабируются и позволяют наработать
достаточное количество белкового препарата для последующих стадий тонкой очистки с использованием хроматографических методик.
2.2. Хроматографические методы очистки белков
Хроматография – это процесс движения вещества в системе двух фаз, одна из которых перемещается относительно
другой. Это перемещение увлекает вещество и обуславливает его миграцию, в ходе которой оно непрерывно перераспределяется между двумя фазами. Скорость миграции
зависит от соотношения степеней сродства вещества к подвижной и неподвижной фазам. Если эти соотношения для
компонентов исходной смеси неодинаковы, то они мигрируют с разными скоростями и их удается физически разделить друг от друга после того, как они пройдут достаточный
для такого разделения путь.
Детектирование компонентов, выходящих из хроматографической колонки, можно осуществлять непосредственно в процессе разделения, используя физико-химические
свойства разделяемых молекул (например, поглощение при
определенной длине волны, оптическую активность или показатель преломления). Кроме того, можно собрать неболь-
18
шие фракции, выходящие из колонки и затем провести различные физические, химические или биологические тесты
для определения интересующих фракций.
Гель-проникающая хроматография (гельфильтрация) – это один из наиболее часто используемых
методов при разделении биомолекул. Разделение происходит в порах носителя, причем, в отличие от других видов
хроматографии, не происходит взаимодействие
между ма-
териалом носителя и разделяемым веществом.
Молекулы, чей размер крупнее самых больших пор хроматографического носителя, не проникают внутрь гранул,
мигрируют с потоком элюента и выходят с колонки в первую очередь. Более мелкие молекулы имеют возможность
проникать в поры носителя и задерживаться там, причем,
чем мельче молекулы, тем более продолжительное время
они могут находиться в порах сорбента и, соответственно,
элюируются позже других. Таким образом, происходит разделение молекул по их геометрическим размерам, начиная с
самых крупных и заканчивая самыми маленькими.
Ионообменная хроматография основана на взаимодействии (обратимой сорбции) заряженных макромолекул образца с привитыми к носителю ионообменными группами,
имеющими противоположный заряд. Носители с положительно заряженными группами называются анионообменни-
ками, поскольку позволяют проводить обмен отрицательно
заряженных анионов. Носители с отрицательно заряженными
группами называются катионообменниками.
На первой стадии процесса (уравновешивание) колонку
переводят в стартовые условия (рН, состав буфера и ионная
сила), которые обеспечивают сорбцию интересующих молекул образца. На этой стадии привитые ионообменные
группы носителя насыщаются соответствующими противоионами (обычно простыми катионами или анионами, такими как ионы хлора или натрия).
На второй стадии происходит сорбция образца, во время
которой происходит замещение противоионов заряженными
19
молекулами. Несвязавшуюся часть образца вымывают из
колонки стартовым буфером.
На третьей стадии в состав буфера вводятся такие компоненты, которые нарушают взаимодействие между носителем и связавшимся образцом и молекулы образца элюируются из колонки. Для этих целей обычно используют градиентное элюирование возрастающей концентрацией соли
или изменение рН (градиент концентраций
создается в смесителе градиента). В процессе градиентного элюирования
вначале выходят слабо связавшиеся компоненты, сильно
сорбирующиеся компоненты выходят в конце процесса.
В ионообменной хроматографии можно применять два
метода выделения интересующих макромолекул. Первый
заключается в связывании молекул интереса на материале
носителя, отделении примесей промывкой и градиентном
элюировании связавшихся компонентов. Второй метод, наоборот, заключается в связывании примесей, а выделяемые
молекулы проходят через колонку не сорбируясь. В большинстве случаев используют первый метод, поскольку он
позволяет проводить не только более тонкое фракционирование, но и концентрирование компонентов.
Гидрофобная хроматография основана на взаимодействии входящих в состав белка гидрофобных аминокислот с
гидрофобными группами сорбента. Хроматографическое
разделение по степени гидрофобности обычно начинается с
сорбции образца на поверхность гидрофобного носителя.
Поскольку гидрофобные взаимодействия усиливаются с
увеличением ионной силы раствора, образец наносится при
высокой ионной силе. Это делает гидрофобную хроматографию высокоэффективным шагом очистки после осаждения белков сульфатом аммония или элюирования высокими
концентрациями солей при проведении ионообменной хроматографии.
После адсорбции смеси белков при высокой ионной силе
на поверхности гидрофобного носителя, необходимо провести селективное элюирование индивидуальных белковых
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]