Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
компонентов. Для этого применяют постепенное снижение
ионной силы элюента, при этом белки вымываются из колонки по мере ослабления гидрофобных взаимодействий.
Гидрофобные взаимодействия можно также разрушить путем понижения полярности среды (к примеру, добавлением
этиленгликоля) или при введении в элюирующий буфер неионогенного поверхностно-активного вещества.
Аффинная хроматография основана на высокоспеци
фичном выделении одного из компонентов разделяемой
смеси при его взаимодействии с селективным носителем.
При разделении биомолекул специфический отбор происходит на стадии сорбции, поскольку выделяемая молекула
обладает специфическим сродством к соответствующему
лиганду, закрепленному на поверхности носителя.
Иммуноаффминная хроматография – особый тип разделения белков, в основе которого лежит взаимодействие
антиген-антитело. Если на поверхность носителя в качестве
аффинного лиганда прививается антитело, полученное против белка, то мы имеем дело с иммуноаффинным сорбентом. Соответственно, разделение белков с использованием
такого сорбента и называют иммуноаффинной хроматографией. Антитела высокоспецифичны и имеют очень высокое
сродство к белкам-антигенам – константы диссоциации
комплексов антиген-антитело имеют величины 10-9–10
-12
М,
в то время как при обычном аффинном взаимодействии эти
константы характеризуются величинами 10-5–10-6 М. С одной стороны, это позволяет осуществлять более избирательную сорбцию, чем на сорбентах других типов. С другой
стороны, для разрушения комплекса антитело-антиген приходится использовать весьма жесткие условия на стадии
элюирования интересующего белка, например, понижение
рН элюента до значения 2–3. Антитела обычно хорошо выдерживают такие жесткие условия элюирования, что не всегда можно сказать об интересующих белках (в особенности
ферментов).
-
21
Металло-хелатная аффинная хроматография в настоящее время применяется для выделения рекомбинантных
белков. Хелаты – комплексные соединения иона металла с
координированными вокруг него органическими лигандами.
Ионы металлов, иммобилизованных на поверхности носителя (Ni2+, Zn2+, Сu2+, реже Co2+, Fe2+, Ca2+ и др.) образуют
устойчивые комплексы с имидазольной группой гистидина.
Наличие на поверхности белка нескольких близко расположенных остатков гистидина резко усиливает его специфическую сорбцию на хелатном носителе.
В качестве аффинной метки в белках чаще всего используют так называемую таг-последовательность (His-tag), состоящую из нескольких остатков гистидина (обычно 6–12),
вводимую генно-инженерными методами на N- или С-конец
аминокислотной последовательности целевого белка. Подобная метка имеет небольшой размер, легко синтезируется
в клетках и редко влияет на такие важные характеристики
белка, как специфическая активность или структура.
Очистка белков, содержащих в своей структуре ТАГ,
достаточно проста. Уже на первом этапе очистки металлохелатная хроматография
позволяет отделить значительную
часть примесных белков и достичь 90–95 % чистоты выделяемого белка.
В качестве аффинных лигандов могут выступать и другие вещества с высокой избирательностью к тому или иному белку. В случае ферментов, к ним можно отнести специфические субстраты, ингибиторы или кофакторы, привитые
на поверхность хроматографического носителя. В некоторых случаях аффинными сорбентами могут выступать нерастворимые субстраты, такие как целлюлоза для целлюлаз,
крахмал для амилаз или желатин для протеиназ.
Хроматофокусирование – частный случаей ионообменной хроматографии, при котором белки или другие биомолекулы разделяются в системе подвижной и неподвижной
фаз в соответствии с их изоэлектрическими точками. Изоэлектрическая точка белка (pI) – величина рН среды, при
22
которой суммарный заряд белковой глобулы равен нулю.
Выше pI (в более щелочной среде) белок заряжен отрицательно, ниже pI – положительно.
Хроматофокусирование использует буферный эффект заряженных групп самого ионообменника, и градиент рН
формируется автоматически по мере того, как элюирующий
буфер проходит через слой ионообменника. Вначале анионообменную колонку уравновешивают щелочным буфером,
а элюент (полибуфер) доводят до более низкого значения
рН. Полибуфер содержит большое количество разнообразных заряженных групп и его буферная емкость равна буферной емкости ионообменника в широком диапазоне рН.
По мере прохождения полибуфера через колонку, его кислые компоненты связываются со щелочными группами ионообменника, и рН постепенно понижается по длине
колон-
ки, образуя плавный градиент от начала колонки к ее концу.
Если на колонку был нанесен образец, содержащий смесь
белков, то они распределятся по колонке в соответствии с рН
и изоэлектрическими точками. Белок будет двигаться до тех
пор, пока не достигнет точки, где рН будет равно его pI, после чего его движение резко замедлится. Молекула останется
связанной до тех пор, пока рН формирующего градиента не
станет ниже pI белка. Тогда белок начнет опять продвигаться
с элюирующем буфером до тех пор, пока рН не станет выше
pI, и белок вновь свяжется с ионообменником. Этот процесс
будет повторяться до тех пор, пока белок не выйдет из колонки в соответствии с его изоэлектрической точкой.
2.3. Дополнительные процедуры при выделении белков
Дополнительные процедуры при очистке белков связаны
с особенностями растворов, получаемых на различных стадиях их выделения. Так, при дробном фракционировании
грубых белковых экстрактов или после проведения ионообменной хроматографии в увеличивающемся градиенте соли
получают растворы с высокой ионной силой. Увеличение
23
ионной силы раствора вызывает ослабление электростатических контактов и усиливает гидрофобные взаимодействия, что негативно сказывается на конформации белка
(снижая, в частности, активность ферментов).
Для снижения ионной силы проводят обессоливание раствора. С этой целью можно использовать гельпроникающую хроматографию на носителях с малым средним диаметром пор (белок будет
выходить в «проскоке», в
то время как низкомолекулярные соли задержатся на колонке). Наиболее часто применяемый метод обессоливания –
диализ. Белковый раствор заливают в диализный мешок и
помещают в большой объем раствора с требуемой ионной
силой. Полупроницаемая диализная мембрана не пропускает высокомолекулярные вещества, но способна пропускать
низкомолекулярные. За счет диффузионного выравнивания
концентраций между содержимым мешка и внешним раствором через определенное время (обычно сутки) концентрация солей в мешке становится равна концентрации солей
в обменном растворе. Процедура диализа используется также и в случае необходимости изменения рН буфера и даже
для его смены. Концентрирование разбавленных белковых
растворов после хроматографии проводится с помощью
ультрафильтрации. Финальная стадия выделения белка –
перевод его в сухую форму. Для этого используют лиофилизацию – процесс, основанный на возгонке воды из замороженного препарата при низком давлении.
2.4. Контроль качества очистки (гель-электрофорез)
Электрофорез – движение молекул в соответствии со
своим зарядом в электрическом поле. Гель-электрофорез –
метод разделения белков, в котором используется неоднородная разделяющая система с полиакриламидным гелем в
качестве носителя. Гель-электрофорез применяется для аналитического разделения белков и полипептидов по размерам молекул и определения их молекулярной массы, а так-
24
же определения степени чистоты белков. Белковый электрофорез проводят в полиакриламидном геле, помещенном
в вертикальную камеру. Белковые препараты наносят в
верхнюю часть геля, и они перемещаются вниз под действием электрического поля, причем скорость движения молекул пропорциональна их заряду.
Полиакриламидный гель, представляющий собой продукт
сополимеризации акриламида и сшивающего агента N,N’метиленбисакриламида (бис-акриламид), имеет структуру
трехмерной сетки. В связи с этим в неденатурирующих ус-
ловиях отдельные молекулы исследуемых смесей распределяются в электрическом поле не только в соответствии с их
зарядом, но и в зависимости от молекулярной массы и формы. Таким образом, белки с различными молекулярными
массами могут иметь одинаковую
подвижность.
Для унификации движения белков применяют гельэлектрофорез в денатурирующих условиях. Додецилсульфат
натрия является анионным детергентом белков, то есть вызывает денатурацию белковой глобулы. Дополнительная обработка реакционной смеси реагентами, восстанавливающими дисульфидные связи (2-меркаптоэтанол, дитиотрийтол и
т. д.), приводит к дальнейшей денатурации белков и разрушению белок-белковых комплексов. В этом случае единственным фактором, который может повлиять на подвижность
белков в полиакриламидном геле является размер белка, а
точнее его молекулярная масса. Подвижность обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы белка.
Гель-электрофорез в денатурирующих условиях проводят после каждой хроматографической стадии. Количество
и интенсивность белковых полос говорит об относительной
чистоте препарата. Если на хроматограмме проявляется
только одна полоса целевого белка, можно с уверенность
говорить о гомогенности (как минимум 95%-й чистоте) полученного белка.
25
2.5. Идентификация белков
Доказательством того, что выделен искомый белок, является его аминокислотная последовательность, определенная
методом секвенирования.
Один из ранних методов – секвенирование по Эдману. Он
основан на способности фенилизотиоцианата взаимодействовать с N-концевой аминокислотой белка, в результате чего
эта аминокислота отщепляется в виде фенилгидантиона (соединения аминокислоты с фенилизотиоцианатом). Хроматографический анализ фенилгидантиона позволяет определить
N-концевую аминокислоту, после чего процедуру повторяют
несколько раз с укороченными молекулами белка. Данный
метод весьма сложен ввиду большого количества побочных
продуктов, что не позволяет определять последовательность
более чем 5–8 аминокислот с N-конца белковой молекулы. В
настоящее время для определения аминокислотной последовательности используют масс-спектрометрическое картиро-
продуктов протеолиза белка.
вание
Принцип этого метода довольно прост (рис. 2.1). Белок
рассматривается как нитка с нанизанными бусинами 20 различных цветов (аминокислотная последовательность), а
специфическую протеиназу можно представить себе как
ножницы, разрезающие эту нитку после бусины определенного цвета. Во главе угла данного подхода стоит именно
первичная специфичность используемой протеазы (предпочтительность к той или иной аминокислоте, образующей
расщепляемую пептидную связь своей карбоксильной группой, Р1-положение). Если на ранних этапах развития протеомики в качестве расщепляющего агента использовали исключительно трипсин (первичная специфичность к положительно заряженным аминокислотам – аргинину и лизину),
то позднее выяснилось, что он не всегда удовлетворяет требованиям конкретного исследования. Трипсин, например,
плохо расщепляет относительно гидрофобные белки или
белки с высоким содержанием отрицательно заряженных
26
аминокислот. В таких случаях могут быть использованы,
например, химотрипсин (расщепление по гидрофобным
аминокислотам – тирозин, фенилаланин, триптофан) или
глутамилэндопептидаза (расщепление по отрицательно заряженным аминокислотам – аспарагиновая и глутаминовая
кислоты).
Рис. 2.1. Схема идентификации белка МАЛДИ МС картированием пеп-
тидных масс
2
Адаптировано из: MALDI MS – a practical guide to instrumentation,
methods and applications. /F.Hillencamp, P.-K.Jasna, Eds.// Wiley-VCH
Verlag GmbH & Co: Weinheim, 2007
27
2
.
Набор масс образовавшихся продуктов протеолиза обусловлен взаиморасположением сайтов расщепления первичной последовательности и аминокислотами, находящимися между этими сайтами. С другой стороны, возможно
провести теоретическое расщепление любой белковой последовательности протеиназой той или иной специфичности
с получением потенциального набора масс продуктов протеолиза для данной последовательности. Белок идентифицируется как последовательность, генерирующая максимальное совпадение между экспериментальной пептидной
картой масс (набор масс продуктов протеолиза, «фингерпринт») и теоретически возможным набором масс пептидов
каждого для индивидуального белка из базы белковых последовательностей. На практике подобная идентификация
осуществляется оптимизированными поисковыми алгоритмами и схемами подсчета, встроенными в легко используемые программы. Поисковая
система выдает несколько возможных кандидатов, и вероятности того, что в образце содержится именно этот белок или пептид (выдаваемая величина вероятности называется «скор» (Score)). Следует, учитывать, что в разных базах аминокислотные последовательности белков могут быть различными.
2.6. Методы определения активности ферментов
Скорость ферментативной реакции v по определению
равна уменьшению концентрации субстрата [S] или увеличению концентрации продукта реакции [P] во времени t:
v
]d[S
d
]d[P
tt
d
(2.1)
Таким образом, задача определения скорости процесса
сводится к выбору инструментального метода, позволяющего фиксировать изменение концентрации субстрата или
28
продукта в растворе. На практике стремятся определять накопление продукта, а не расход субстрата, поскольку при
этом повышается точность измерений.
Время и концентрации субстрата и продукта ферментативной реакции могут быть выражены в разных единицах
измерения. С целью унификации в 1971 г. Комиссия по
ферментам Международного Союза Биохимиков (IUB) ввела международную единицу
активности (IU, в русскоязычной литературе – МЕ) – количество фермента, трансформирующее 1 мкмоль субстрата в минуту при фиксированных
значениях температуры и рН реакционной среды.
В системе СИ единицей активности является катал (кат) –
количество фермента, трансформирующего 1 моль субстрата
в сек, то есть 1 МЕ = 0,000000016667 кат, а 1 кат = 60000000
МЕ. Поскольку катал – очень крупная единица измерения,
на практике для характеристики активности ферментов используют именно международные единицы активности.
Рассмотрим набор основных методов регистрации концентраций веществ, наиболее часто применяемых в энзимологии для определения скорости ферментативных реакций.
Абсорбционная спектрометрия (фотометрия в
УФ/видимом диапазоне)
. Электронные оболочки молекул
могут находиться в основном (минимальная энергия) и возбужденном состоянии. Если энергия кванта электромагнитного излучения, падающего на молекулу, совпадает с разностью энергий основного и возбужденного состояний, то
может происходить поглощение этого кванта молекулой с
ее переходом в возбужденное состояние. Для электронных
спектров поглощения молекулы (переход одного
из ее электронов на более высокий энергетический уровень) диапазон
используемых длин волн (соответствующих энергий квантов) лежит в пределах от 190 до 700 нм. Деление на УФ,
(190–400 нм) и видимую область (400–700 нм) определяется
источником излучения – лампой накаливания или УФ лампой – которые в современных приборах переключаются автоматически.
29
Если происходит поглощение света раствором вещества,
то интенсивность прошедшего через кювету луча света падает. Отношение интенсивности вышедшего из слоя светового потока Y к интенсивности вошедшего I
носит название
o
пропускания слоя T и зависит от концентрации вещества c и
длины оптического l пути согласно закону БугераЛамберта-Бера:
I
T
I
)ln(ocl
(2.2)
Десятичный логарифм обратной величины пропускания
называют оптической плотностью слоя D:
1
D
lg(
lc
)
(2.3)
T
Параметр
называют коэффициентом молярного погло-
щения при данной длине волны. Его физический смысл –
оптическая плотность раствора вещества в концентрации 1
моль/л при длине оптического пути в 1 см, а размерность –
литр/смꞏмоль.
Поглощение света в УФ/видимом диапазоне происходит
за счет различных функциональных группировок (хромофо-
ров). Зависимость оптической плотности раствора вещества
длины волны называют спектром поглощения. На прак-
от
тике при использовании абсорбционной спектрометрии для
определения скорости ферментативной реакции снимают
спектры субстрата и продукта, после чего выбирают длину
волны, соответствующую максимальной разнице в оптической плотности этих веществ. Для этой длины волны и определяют разностный коэффициент молярного поглощения
вещества, за изменением концентрации
которого и следят в
ходе процесса.
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]