Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы исследования качества продуктов питания. Учебное пособие
.pdf
Биосенсор для таких определений содержит иммобилизованную глицериндегидрогеназу.
При анализе полисахаридов (целлюлозы, крахмала)
используют глюкозные сенсоры с иммобилизованной глюкозооксидазой. Перед анализом полисахариды гидролизуют
специфическими ферментами (целлюлозами, амилазами и т.д.).
Такие анализы играют важное экономическое значение, так как
мировое потребление полисахаридов составляет 800 млн. тонн в
год.
Биотестирование сточных вод основано на измерении
дегидрогеназной активности ила в аэротенках. Ферменты
дегидрогеназы катализируют процесс дегидрирования углеводородных субстратов. Для биотестирования вод также используют ферментные сенсоры.
Одно из достижений биотехнологии и биоинженерии –
разработка методов включения живых клеток в полимеры и
твердые носители различной природы – лежит в основе
создания биосенсоров на основе клеток.
Иммобилизованные клетки (растений, животных, человека,
чаще всего микроорганизмов) обладают рядом свойств:
клетки являются доступным биологическим материалом.
•
В отличие от ферментов клетки значительно дешевле и при их
использовании не требуется дорогостоящих стадий очистки;
• методы иммобилизации позволяют получать клетки,
сохраняющие около 100% активности содержащихся в них
ферментов и способные функционировать достаточно
длительные промежутки времени (в ряде случаев до нескольких
лет);
• клетки сохраняют, как правило, все системы
жизнеобеспечения, включая ферментные стадии регенерации
кофакторов. Это позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные про-цессы;
241
• для многих типов клеток, особенно микробных,
разработаны эффективные методы генетических операций,
дающие возможность получать мутанты с высоким
содержанием того или иного белка или фермента. Поскольку
клетки сохраняют способность биосинтеза белка, потенциально
могут быть разработаны высокоэффективные методы
диагностики.
Особенности метаболизма клеток позволяют создавать
биосенсоры как на индивидуальные молекулы, так и на классы
соединений. Для создания клеточных биосенсоров, как и в
случае ферментных, используются различные трансдьюсеры
(амперометрические, потенциометрические,
кондуктометрические, оптические и другие).
Микробные биосенсоры изготавливают на основе
иммобилизованных на какой-либо электрохимический датчик
микроорганизмов.
При культивации микроорганизмов на патоке сахарного
тростника, который содержит различные сахара, для контроля
процесса брожения важно определение суммарного содержания
усваиваемых сахаров в среде. Высокая концентрация сахаров
приводит к подавлению стадии, на которой происходит
расщепление сложных органических молекул до более простых
конечных продуктов.
Усвоение органических соединений микроорганизмами
можно оценивать по их дыхательной активности. В свою
очередь ее измеряют с помощью кислородного электрода.
Повышение концентрации глюкозы в растворе приводит к
увеличению поглощения кислорода в растворе. В результате
электродный ток постепенно понижается, достигая
стационарного значения. В качестве биокомпонента в сенсоре
использованы живые клетки B
revibaterium lactofermentum.
Биосенсор позволяет обнаруживать глюкозу, фруктозу и
сахарозу при концентрации до 0,8 – 1 мМ/л.
242
Избирательные определения глюкозы в той же патоке
можно проводить с использованием микробного сенсора с
иммобилизованными на кислородном электроде клетками
Pseudomonas fluorescense. Определениям глюкозы не мешают
фруктоза, галактоза, сахароза и аминокислоты.
При выращивании микроорганизмов на уксусной кислоте
избыток кислоты подавляет их рост. Оптимальную
концентрацию кислоты поддерживают с помощью микробного
сенсора. В качестве биокатализатора используют
иммобилизованные на тефлон дрожжи Trichosporon brassicae.
Предел обнаружения уксусной кислоты в культуральной
жидкости составляет 5 мг/л. Определениям не мешают метанол,
муравьиная кислота, глюкоза, фосфат-ионы.
В бродильных производствах необходимо непрерывно
определять концентрацию метанола и этанола в культуральных
средах. Этанольный сенсор изготавливают, используя
иммобилизованные на кислородном электроде клетки
richosporon brassice. Работе сенсора не мешают такие
T
соединения, как метанол, муравьиная, уксусная и пропионовая
кислоты, а также углеводы, аминокислоты, неорганические
соединения. Предел обнаружения сенсора составляет 2 мг/л.
Биохимическое потребление кислорода (БПК) – один из
главных показателей загрязнения сточных вод органическими
веществами. Обычное определение БПК требует пятидневной
инкубации. Для экспрессного (за час) определения БПК
выпускается биосенсорная система, основанная на
использовании иммобилизованных бактерий Trichosporon
cutaneum.
В таблице 11.1 приведены сведения о составе
биокаталитических материалов, используемых в
чувствительных слоях биосенсоров при определении различных
субстратов, а также о типе пребразователя – амперометрических
и потенциометрических датчиках.
243
Таблица 11.1. Биосенсоры на основе растительных и животных
тканей и клеток
Определяемый
субстрат
Биокаталитический
материал
Чувствитель-
ный элемент
Глутамин Клетки почки свиньи NН3 - датчик
Аденозин Клетки слизистой обо-
NН3 - датчик
лочки тонкого
кишечника мыши
Аденозин-S-
Мышца кролика NН3 - датчик
монофосфат
Гуанин Печень кролика NН3 - датчик
Пероксид
Печень быка О2-датчик
водорода
Глутамат Желтая тыква СО2-датчик
Пируват Кукурузное зерно СО2-датчик
Мочевина Мука из бобов
NН3 - датчик
канавалии мечевидной
Фосфат/фторид
ионы
Клубень
картофеля/глюкозоокс
О2-датчик
идаза
Допамин Мякоть банана О2-датчик
Тирозин Сахарная свекла О2-датчик
Цистеин Лист огурца NН3 - датчик
Принципиальным вопросом при создании биосенсоров,
особенно клеточных, является способ иммобилизации
биокаталитического материала.
В биосенсорной технологии важным требованием является
предотвращение утечки биокомпонента (катализатора) в
244
процессе эксплуатации сенсора. Для обеспечения надежной
работы этих аналитических устройств также требуется:
• высокая специфичность биологического компонента к
определяемым веществам;
• устойчивость системы к колебаниям температуры,
ионной силы, рН, окислительно-восстановительного потенциала
и химического состава окружающей датчик среды;
• исключение возможности загрязнения или биологической
деградации биокомпонента в процессе эксплуатации
биосенсора;
• исключение возможности инфицирования пациента при
использовании биосенсора in vivo.
Выполнение этих условий во многом зависит от способов
иммобилизации (закрепления) биокомпонента – элемента
химически чувствительного слоя. Кроме того, от способа
иммобилизации зависят каталитическая активность и
стабильность биокомпонента. Устойчивость фермента
повышается при введении его в гелевый носитель (желатину,
агар, альгинат кальция, каррагенан). В последние годы
разработаны методы включения живых клеток в синтетические
полимерные гели. Например, электрод для определения
мочевины с химически связанной на поверхности ИСЭ уреазой
может работать без изменений свойств более 300 дней.
Чаще всего используют четыре основных подхода к
иммобилизации фермента и других биокомпонентов:
физическая адсорбция на твердой поверхности;
•
• захват в полимерном геле или в микрокапсулах;
• поперечное связывание с помощью бифункциональных
реагентов. Часто этот способ сочетается с двумя первыми;
• ковалентное связывание с реакционноспособной
нерастворимой подложкой. Эти способы иллюстрируются
рисунком 11.2.
245
Захват в гелевом носителе один из наиболее часто
EEEEEEСшивание
E
E
EEEEE
Захват
носителем
EEE
используемых методов иммобилизации биокомпонентов. Для
этих целей чаще используют альгинатный или желатин/коллагеновый гели с белками, сшитыми поперечными
связями. Сшивание линейных цепей альгината, например,
проводят с помощью ионов кальция.
Закрепление биокомпонентов на поверхности стекла,
силикагеля и других подложек может проводиться за счет их
адгезионных свойств (дрожжевые клетки), или химической
иммобилизации после реакции с бифункциональными
реагентами, закрепленными ковалентно на предварительно
обработанной поверхности.
E
E
E
Адсорбция и сшивание
Ковалентное
связывание
E
E
Адсорбция
Микроинкапсулирование
Рис. 11.2. Способы иммобилизации ферментов и других
биокомпонентов в сенсорах
246
Каждый из способов иммобилизации имеет свои
достоинства и ограничения. К примеру, физическая адсорбция
практически не меняет ферментативную активность
биокомпонента. Однако биокомпонент в этом случае может
легко вымываться с подложки при изменении рН, ионной силы,
температуры и других факторов. Захват гелем создает
диффузионные ограничения для субстратов и образующихся
продуктов, а также приводит к уменьшению содержания
биокатализатора и снижению ферментативной активности ЧС.
Одним из лучших способов иммобилизации является
ковалентное связывание на подложку. В этом случае
практически исключается утечка биокатализатора из матрицы.
Функционирование ферментного электрода можно
рассматривать как пятистадийный процесс, включающий в себя:
подвод субстрата к поверхности электрода;
•
• диффузию субстрата через мембрану к активному центру;
• реакцию в активном центре;
• перенос продукта ферментной реакции через мембрану к
поверхности электрода;
• определение продукта вблизи поверхности электрода.
Первая стадия сильно зависит от скорости перемешивания
анализируемого раствора и повышение ее интенсивности
обеспечивает быстрый перенос субстрата к поверхности
электрода. При использовании очень тонкой мембраны и
высокоактивного фермента вторая и четвертая стадии также
оказывают минимальное влияние. Третья стадия также является
очень быстрой, поэтому время отклика ферментного электрода
теоретически должно быть близким ко времени отклика
базового электрода (пятая стадия).
Химические сенсоры, в отличие биосенсоров, содержат
химический чувствительный слой, дающий отклик на
присутствие определяемых веществ. Ряд химических сенсоров
функционируют на принципах химической реакции, когда
247
аналитический сигнал возникает вследствие химического
взаимодействия определяемого компонента с чувствительным
слоем. В этом случае ЧС выполняет роль химического
преобразователя. В большей части химических сенсоров
используется физический принцип, когда измеряется какой-то
физический параметр (поглощение света, изменение массы или
проводимости и др.).
Избирательность определения веществ в химических
сенсорах может регулироваться за счет использования
различных мембран (газопроницаемых, ионообменных,
диализных и др.). Их роль заключается в обеспечении
избирательной диффузии определяемых веществ через
полупроницаемую мембрану к слою химического преобразователя.
Для конструирования химических сенсоров используют
электрохимические (потенциометрические, амперометрические, кондуктометрические), оптические (спектрофотометрические, люминесцентные), электрические, калориметриические, пьезоэлектрические, поверхностно-акустические и
другие преобразователи.
Применение электрохимических преобразователей
(амперометрических, потенциометрических) с биологическими
компонентами чувствительного слоя рассмотрено выше. На
практике широкое распространение в промышленном анализе
находят и другие типы электрохимических преобразователей.
Классическим примером химического сенсора, используемого
для определения рН, можно считать рН-метрический анализатор
со стеклянным индикаторным электродом.
Для непрерывного определения содержания СО
в воздухе
2
используют сенсоры с кондуктометрическим детектированием.
Принцип работы сенсора можно рассмотреть на примере схемы,
приведенной на рис. 11.3.
248
-
CO
2
1
2
3
CO
2
H+ + HCO
3
Рис. 11.3. Схема кондуктометрического преобразователя с
газопроницаемой мембраной: 1 – газодиффузионная мембрана,
– электроды, 3 – электролит (вода)
2
Диоксид углерода из воздуха диффундирует через
газопроницаемую мембрану и, растворяясь в воде, образует
ионы H+ и HCO
−
в количестве, пропорциональном содержанию
3
СО2 в воздухе. Разница в электропроводности фонового и
анализируемого раствора и является аналитическим сигналом.
Шкала прибора градуируется в единицах ppm СО
2.
Этот же принцип детектирования используют для
определения содержания органических соединений в воде,
используемой в фармацевтике, радиоэлектронной промышленности, где требуется особо чистая вода. Органические
вещества окисляются персульфатом аммония в сернокислой
среде с образованием СО2, который определяется кондуктометрическим датчиком. Предел обнаружения органических
веществ при этом достигает 10-9 М/л.
В этом сенсорном анализаторе определение компонента
происходит непрямым (косвенным) способом после протекания
химической реакции двуокиси углерода с электролитом и
образования ионов. В то же время электрохимические
249
превращения определяемого компонента могут происходить
непосредственно на электроде (так называемые
газодиффузионные электроды).
Электрохимические преобразователи с
амперометрическим, кулонометрическим и
кондуктометрическим детектированием используют для
определения токсичных газов (паров) – SО2, COCl2, N2H4, H2S,
CO, кислорода и других веществ в газовых средах.
Модификация поверхности электрода соединениями
различной природы позволяет повышать селективность
определений. На обычных электродах, например, диоксид азота
и кислород восстанавливаются при близких значениях
потенциала и различить их при совместном присутствии
практически невозможно. Если ЧС сенсора модифицируется
фталоцианиновым комплексом кобальта, то восстановление
диоксида азота происходит при невысоких значениях
потенциала, в то время как восстановление кислорода при этом
не происходит. Это позволяет проводить раздельное
определение NO
.
2
Mногоканальные электрохимические сенсорные анализа-
торы, в которых используют электроды различной природы, в
последние годы используют для экспресс-идентификации
различных продуктов, в том числе напитков, алкогольной
продукции.
Развитие электрохимических сенсоров продолжается в
направлении создания так называемых одноразовых электродов.
Они изготавливаются по планарной технологии (так называемые
screen-printed электроды). На матрице формата А4 можно
"напечатать" до нескольких сот сенсорных элементов. Для их
изготовления используют специальные углеродсодержащие
чернила и носитель на керамической или пластиковой основе
или бумага специального состава. Состав чернил определяет
свойства или характер отклика screen-printed электрода. На
250
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]