Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы исследования качества продуктов питания. Учебное пособие
.pdf
Таблица 3.2. Неподвижные жидкие фазы для газовой
хроматографии
Класс
веществ
Углеводороды сквалан
Силиконы метилсиликон
Полигликоли Полиэтиленгликоль
Сложные
эфиры
Представитель Рабочий
диапазон
температур
20-150
аполан-87
(OV-1, SE-30)
фенилсиликон
(OV-22)
нитрилсиликоновое
масло
(карбовакс)
ПолиэтиленгликольСукцинат
диизодециладипинат
50-300
00-300 неполярный
2
50-225 Полярный
100-200
20-125
Полярность
неполярный
неполярный
средней
полярности
сильно
полярный
Сильно
полярный
Средней
полярности
3.3 ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Согласно классификации хроматографических методов по
агрегатному состоянию фаз все хроматографические методы,
использующие в качестве подвижной фазы жидкость, относят к
жидкостной хроматографии (ЖХ). В пределах этой большой
группы методы классифицируют по механизму взаимодействия
молекул сорбата с неподвижной фазой: адсорбционная,
распределительная, ионообменная и ситовая (эксклюзионная)
хроматография.
Благодаря ряду преимуществ ЖХ в последние десятилетия
получила все большее распространение по сравнению с ГХ.
Методом ЖХ можно анализировать смеси практически всех
растворимых веществ, в том числе и тех, которые не могут быть
41
проанализированы методом газовой хроматографии из-за их
высоких температур кипения или термолабильности.
Разделение в ЖХ проводят при низких температурах (20—
60°С). Это улучшает разделение. Значительно более высокая
эффективность разделения по сравнению с ГХ (число
теоретических тарелок достигает до сотни тысяч на 1 м
колонки).
В классическом варианте ЖХ, берущей начало с
основополагающей работы Цвета (1906 г.), частицы
неподвижной фазы имеют диаметр от 100 мкм и выше.
Жидкость по колонке передвигается за счет силы тяжести,
отдельные фракции элюата собираются и затем анализируются.
При этом скорость потока подвижной фазы составляла не более
мл/мин, и разделение часто оказывалось слишком длительным.
1
Начиная с 60-х годов прошлого века развивается вариант
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В
этом варианте используются сорбенты с размером частиц 3-10
мкм. Из кинетической теории известно, что высота, эквивалентная теоретической тарелке, зависит от коэффициента
сопротивления массопереноса (С), который в свою очередь
прямо пропорционален квадрату размера частиц носителя.
Уменьшение размеров зерен существенно уменьшает ВЭТТ и
увеличивает эффективность колонки. Кроме того, применение
узких колонок с внутренним диаметром 4—6 мм вызвало
необходимость повысить давление на входе в колонку до 15—
400 МПа, чтобы увеличить скорость прохождения элюента.
Одновременно были разработаны детекторы, позволяющие
определять до 10
-10
г вещества: фотометрические (в УФ и
видимой области), рефрактометрические, флуориметрические,
амперометрические.
Большим достоинством ВЭЖХ является возможность
реализовать все механизмы разделения - адсорбционный,
распределительный, ионообменный, эксклюзионный. Основные
42
теоретические положения ВЭЖХ и классической колоночной
ЖХ практически одинаковы.
Первым был реализован адсорбционный механизм в
форме жидкостно-твердофазной хроматографии. В настоящее
время этот вид хроматографии используется для разделения
неполярных веществ, пространственных изомеров, а также
группового разделения, например, алифатических углеводородов и алифатических спиртов. Распределительный механизм
лежит в основе жидкость-жидкостной хроматографии. Здесь
наибольшее распространение получил варинт обращеннофазовой хроматографии. В основе ионообменной хроматографии лежит явление ионного обмена. Эксклюзионная
хроматография основана на молекулярно-ситовом эффекте, т.е.
разделении молекул на пористом материале в соответствии с их
размерами. Эти методы обычно называют гель-хроматографией.
Аппаратура в высокоэффективной жидкостной
хроматографии
Жидкостный хроматограф является более сложным
аналитическим прибором по сравнению с газовым. Это связано
с тем, что система подачи элюента включает дополнительные
узлы: блок дегазации, устройство для создания градиента,
насосы, систему поддержания и измерения давления.
На рис.3. 7 приведена блок-схема современного комплекса
для ВЭЖХ, которая высвечивается на мониторе и используется
для активизации тех или иных блоков прибора в процессе его
работы.
Насосы обеспечивают постоянную скорость потока
3
элюента от 0,1 до 10 см
/мин при давлении до 400 атм. Для
удаления газов из растворителей применяются специальные
дегазаторы.
43
В жидкостной хроматографии различают изократический
и градиентный режим элюирования. В изократическом режиме
через колонку непрерывно пропускают подвижную фазу
постоянного состава. При градиентном элюировании состав
подвижной фазы в ходе разделения меняется согласно
специально задаваемой программе. Можно, например,
непрерывно изменять полярность элюента, изменяя
относительные содержания компонентов в водно-метанольной
смеси. Это позволяет значительно сократить время разделения,
улучшить параметры разделения.
Рис. 3.7. Блок-схема жидкостного хроматографа. 1 - инжектор
(устройство ввода пробы); 2 - насос; 3 - колонка; 4 и 9 -
детекторы (диодно-матичный и флуоресцентный); 5, 6 и 7 системно-программный комплекс ("Химическая Станция"),
позволяющий получать графическую информацию о разделении
веществ (хроматограмму), проводить интегрирование
результатов анализа, количественную обработку, оперировать
со спектральной информацией; 8 - программируемое
устройство для создания градиентного элюирования.
В методе ВЭЖХ применяют стандартные прямые
колонки длиной 10, 15, 25 см с внутренним диаметром 4-5,5 см.
44
Варианты высокоэффективной жидкостной
Si
О
О
О
О
О
О
Si
О
ОOHО
Si
О
НОSi
О
OH
О
2
3
хроматографии
В адсорбционной (нормально-фазной) хроматографии
разделение осуществляется в результате взаимодействия
вещества с полярным адсорбентом (как правило, силикагелем),
имеющем на поверхности активные группы (силанольные,
силоксановые и др., рис. 3.8).
1
OH
Рис. 3.8. Активные
группы на поверхности
силикагеля: 1 -
Si
Si
связанные водородной
связью силанольные; 2 свободные силанольные
SiOH; 3 - силоксановые
О
Si-O-Si
Разделение смеси веществ на отдельные зоны при
прохождении ее через хроматографическую колонку обусловлено различием в их способности к взаимодействию с
адсорбционными центрами неподвижной фазы. В основе
сорбции на поверхности адсорбента, имеющего в основном
гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие
между полярной поверхностью сорбента и полярными (или
способными поляризоваться) группами и участками молекул.
К ним можно отнести диполь-дипольное взаимодействие
между постоянными или индуцированными диполями,
образование водородной связи вплоть до образования π
π-
π
π
комплексов или комплексов с переносом заряда. В отдельных
случаях возможна хемосорбция, приводящая к образованию
продуктов разложения или необратимой сорбции вещества.
45
Недостатки адсорбционной хроматографии (НФ-ВЭЖХ)
связаны со способностью полярной неподвижной фазы
(силикагеля или оксида алюминия) удерживать на своей
поверхности микроколичества воды. Алканы (гексан, гептан и
другие растворители), используемые в качестве основных
элюентов в НФ-ВЭЖХ, содержат небольшие количества воды
(на уровне десятков ррм). Силикагель, находящийся в колонке в
качестве сорбента, выступает как осушитель этих
растворителей, меняя при этом свою активность. Это приводит к
изменению (плохой воспроизводимости) параметров
удерживания разделяемых веществ (tr, Vr), а также
селективности разделения. По этой причине НФ-ВЭЖХ на
силикагеле (окиси алюминия) была вытеснена
распределительной ВЭЖХ на сорбентах с привитой фазой в
обращенно-фазовом (ОФ) и нормально-фазовом (НФ)
вариантах. Традиционно принято считать, что в НФ-ВЭЖХ
используют неполярную (малополярную) подвижную фазу и
полярную неподвижную фазу. В ОФ-ВЭЖХ, наоборот,
используется полярная подвижная фаза и неполярная
неподвижная фаза.
В распределительной ВЭЖХ разделение смеси на
компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов
распределения между двумя несмешивающимися фазами:
растворителем (подвижная фаза) и фазой на сорбенте
(неподвижная фаза). Основными привитыми фазами в НФВЭЖХ являются нитрильная и аминная фазы. Эти группы
придают достаточно высокую полярность неподвижной фазе.
Поэтому их можно использовать как в нормально-фазовом
(элюирование неполярными растворителями), так и в
обращенно-фазном (элюирование полярными растворителями)
вариантах. В качестве НФ-сорбентов они проявляют свойства,
подобные силикагелю. Для них характерны те же элюотропные
ряды растворителей, что и для силикагеля.
46
Вариант распределительной хроматографии, в котором
используют сорбент с привитыми неполярными (например,
алкильными) группами и в качестве элюента полярный
растворитель (например, смесь метанола и воды), получил
название обращенно-фазной (ОФ) ВЭЖХ. Этот метод,
использующий неполярную неподвижную фазу и полярную
подвижную фазу, стал основным в ВЭЖХ. Это связано с тем,
что в ОФ-ВЭЖХ используются растворители, пригодные для
растворения практически всех важнейших групп химических
веществ. Кроме того, эти растворители удобны при использовании наиболее популярного в ВЭЖХ спектрофотометрического детектора.
В ионообменной ВЭЖХ (ИХ) разделение компонентов
смеси достигается за счет обратимого взаимодействия веществ,
способных к диссоциации с образованием ионов, с катионо(анионо-)обменными группами сорбента. Сохранение
электронейтральности сорбента обеспечивается присутствием в
растворе противоионов, способных к ионному обмену и
находящихся в непосредственной близости от поверхности
ионообменного сорбента. Разделение смеси ионизированных
веществ происходит в результате различия в их константах
ионного обмена.
К ионообменной хроматографии примыкает ионная
хроматография. Это вариант ионообменной хроматографии, в
которой на первой стадии проводят разделение смеси
компонентов в разбавленном растворе кислоты (основания), а
затем удаляют избыток кислоты (основания) в элюате для
повышения чувствительности определения разделенных ионов
кондуктометрическим детектором. В качестве подвижной фазы
в ИХ используют водные растворы солей кислот, оснований,
являющихся хорошо ионизирующими растворителями.
Механизм ионного обмена можно представить в виде
следующих уравнений:
47
X- + R+Y- ↔↔↔↔ Y- + R+X
R
X+ + R-Y+ ↔↔↔↔ Y+ + R-X
-
(анионный обмен);
+
(катионный обмен).
Удерживание в ИХ зависит от двух процессов. Первый из
них связан с распределением образца между водной подвижной
и органической неподвижной фазами. Вторым является процесс
образования ионных пар (катионный и анионный обмен). Этот
процесс является определяющим в удерживании веществ.
Составы типичных привитых неподвижных фаз, используемых в
НФ, ОФ и ионной хроматографии, приведены на рис. 3.9.
R
O Si
амино,
NH
O Si
бутил,
С
4
O Si
циано, нитрил
O Si
гексил,
C
O Si
метил,
C
1
R
2
R
R
R
R
6
R
(CH2)3NH
(CH2)3CH
(СH2)3CN
R
(СH2)5CH
R
R
CH
3
2
октил,
3
октадецил,
O Si
фенил
3
анионообменная
катионообменная
O Si
O Si
O Si
O Si
R
C
8
R
R
R
R
R
R
(CH2)7CH
(CH2)17CH
C
18
(CH2)
(CH2)
R
(CH2)3SO
R
3
3
3
CH
3
+
3
-
H
CH3Cl
+
-
N
3
CH
3
Рис. 3. 9. Состав типичных фаз (привитых фаз), используемых в
обращенно-фазовой, нормально-фазовой и ионообменной ВЭЖХ
48
Эксклюзионная хроматография
Другим вариантом ВЭЖХ, который используется для
изучения молекулярно-массового распределения и определения
белков, протеинов, других высокомолекулярных соединений,
является эксклюзионная хроматография. Она основана на
использовании в качестве неподвижной фазы пористого тела
или геля. Разделение смеси веществ происходит в результате
различия в размерах молекул веществ, и/или их формы и
способности проникать в поры неподвижной фазы.
Принципиальной особенностью метода является возможность
разделения и определения молекул по их размеру в диапазоне
2
практически любых молекулярных масс - от 10
до 108 у.е.
По традиции процесс разделения, проводимый в
органических растворителях, часто называют гель-
проникающей хроматографией. Если же разделение проводят в
водной системе, то метод называют гель-фильтрационной
хроматографией. Термин "эксклюзионная" более полно
отражает механизм процесса разделения в этом методе, который
заключается в исключении (разделении) молекул по их размеру
(Size Exclusion).
Разделение в этом варианте ВЭЖХ происходит за счет
распределения молекул между растворителем, находящимся
внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его
частицами (рис. 3.10). Роль сорбента (твердого наполнителя
колонки) заключается в формировании пор определенного
размера. Неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Естественно, что применение термина "сорбент" к таким наполнителям в определенной степени условно.
При эксклюзионном варианте ВЭЖХ все молекулы, размер
которых больше размера пор сорбента, не могут в них попасть
(происходит полная эксклюзия) и проходят по каналам между
частицами. Они элюируются из колонки с одним и тем же
49
обьемом удерживания, равным обьему удерживания подвижной
фазы.
Молекулы с промежуточной молекулярной массой
(размерами), способные проникать в поры определенного
диаметра, удерживаются в колонке в соответствии с их
размерами. Существенным отличием эксклюзионной
хроматографии от других вариантов ВЭЖХ является то, что в
ней разделение веществ заканчивается до выхода из колонки
растворителя. В других вариантах ВЭЖХ компоненты смеси
элюируются после растворителя.
Рис.3.10. Модель
разделения молекул по размеру в эксклюзионной ВЭЖХ
Связь между удерживаемым объемом VR и молекулярной
массой (размером молекул) описывается градуировочной
зависимостью (рис.3.11 ).
Каждый сорбент характеризуется своей зависимостью, по
которой можно оценить область разделяемых на нем
молекулярных масс. Точка А на рисунке соответствует пределу
эксклюзии, или мертвому объему колонки V
(объем колонки,
О
занимаемой подвижной фазой). Все молекулы, масса которых
больше, чем соответствующие точке А, будут элюироваться
одним пиком и иметь удерживаемый объем V
50
. Точка В на
О
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]