Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы исследования качества продуктов питания. Учебное пособие
.pdf
сопоставления с интенсивностью света, регистрируемого
фотодиодом при прохождении света через образец. В
большинстве СФ детекторов с изменяемой длиной волны свет
расщепляется для направления части его на второй фотодиод,
обслуживающий канал сравнения. Этот канал сравнения дает
возможность компенсировать колебания интенсивности света,
излучаемого лампой.
Для получения оптимальной чувствительности можно
запрограммировать перенастройку длины волны под каждый
пик, обнаруживаемый во время хроматографического
разделения. Длина волны будет меняться при этом
автоматически. Такой детектор предназначен для регистрации
поглощения только в одной точке спектрограммы в любой
выбранный момент времени. При решении практических задач
часто желательно проведение измерений при различных длинах
волн (например, когда хроматографическая колонка не способна
разделить два вещества, спектрограммы которых различаются).
Если необходимо зарегистрировать спектрограмму вещества,
поток может быть остановлен, чтобы детектор с изменяемой
длиной волны мог просканировать какой-то диапазон спектра.
Детекторы с диодной матрицей (ДМД)
Оптическая система детектора с диодной матрицей
показана на рис.3.15. Ахроматическая линза фокусирует
полихроматический свет (от дейтериевой лампы и лампы
накаливания с вольфрамовой нитью) на проточную кювету.
Пройдя через кювету, луч попадает на поверхность
дифракционной решетки, рассеивающей свет и направляющий
его на матрицу (256, 512 или 1024) фотодиодов. Каждый из них
регистрирует индивидуальную узкую полосу электромагнитного
излучения. Это дает возможность регистрировать сигнал
71
образца в диапазоне от 190 до 950 нм. Такой широкий диапазон
обеспечивается одновременной работой двух ламп.
Обработка сигнала всех фотодиодов во всем диапазоне
длин волн дает возможность получения спектров поглощения
веществ в процессе прохождения образца через детектор.
Ширина полосы света, обнаруживаемого фотодиодом, зависит
от ширины входной щели. Эту ширину можно менять по
программе в диапазоне от 1 до 16 нм. Если необходима высокая
чувствительность, щель расширяется до 16 нм, чем
обеспечивается максимальное пропускание света. В тех случаях,
когда требуется получение максимальной спектральной
разрешающей способности, щель делается максимально узкой
(1нм). При такой настройке детектора возможна регистрация
сверхтонкой структуры спектра бензола даже при регистрации
поглощения А с масштабом 0,0007 е.о.п. на всю шкалу.
Поскольку относительное положение кюветы и дифракционной
решетки оказываются противоположными по сравнению с
используемыми в традиционных приборах, такую оптическую
систему часто называют «системой с переставленной оптикой».
Наиболее существенное отличие ДМ детектора от
традиционного СФ детектора с изменяемой длиной волны
заключается в возможности получения полной спектральной
информации о разделенном веществе. Это позволяет
использовать данные ДМД для автоматического распознавания
присутствие веществ в анализируемых смесях, используя
"библиотеку спектральных данных". Получение спектральной
информации о веществе (хроматографическом пике) происходит
без остановки потока, так как ее регистрация завершается за
несколько миллисекунд.
72
Лам па
нак али ван ия с
Дей тер иев ая
ламп а
Линза
Линза
Ста нда ртн ая
кюв ет а
Про гра мир уем ая
Диф рак цио нн ая
вол ьфрамо вой
нит ью
Фильт р из оки си гол ьдм ия
про точ ная
щел ь
Дио дная м атрица
рке шет ка
Рис.3.15 . Оптическая система детектора с диодной матрицей
На рис.3.16 приведена трехмерная хроматограмма. Как
видно из нее, детектор с диодной матрицей, подключенный к
системе обработки данных, дает возможность подобрать по
результатам разделения оптимальные длины волн для
обнаружения различных веществ. Длины волн, на которых
абсорбция максимальна, легко обнаруживаются по трехмерным
графикам или по графикам, представленным в виде
топографической карты. Эти графики показывают зависимость
интенсивности поглощения от времени (хроматограмму) и от
длины волны (спектрограмму) в виде трехмерного изображения.
Возможность мгновенной съемки спектрограмм и их сохранения
дает возможность создания библиотек спектров, которыми
73
впоследствии можно пользоваться для распознания
компонентов образца при выполнении хроматографических
анализов.
Рис.3.16. Трехмерная (3D) хроматограмма смеси производных
ароматических аминов. По осям X,Y и Z отложены время
элюирования, длина волны и интенсивность поглощения,
соответственно
Параллельная регистрация нескольких хроматограмм на
разных длинах волн дает возможность получения оптимальной
чувствительности в широком спектральном диапазоне. Это
особенно важно при анализе пищевых продуктов, поскольку не
существует одной единственной длины волны, на которой
можно было бы обнаружить все вещества с наибольшей
чувствительностью.
74
Учитывая сложность большинства образцов пищевых
продуктов и продовольственного сырья, возможность проверки
чистоты (гомогенности) пиков позволяет снизить ошибки
количественного анализа. Это представляет еще одно важное
преимущество ДМД перед СФД. При использовании алгоритма
проверки чистоты пиков во время его регистрации
автоматически снимаются несколько спектрограмм, которые
при обработке данных автоматически сопоставляются.
Совмещение таких спектрограмм сведением к одному и тому же
масштабу дает возможность визуального или компьютерного
сопоставления. Если во время разработки метода была собрана
библиотека спектров, ее можно использовать для
подтверждения чистоты (гомогенности) пиков. Спектрограммы
обнаруженных веществ могут быть сопоставлены с
записанными в библиотеку, для чего можно воспользоваться
диалоговым режимом или режимом автоматического
библиотечного поиска.
Флуоресцентный детектор (ФЛД)
Флуоресценция - это специфичный вид люминесценции,
возникающий, когда конкретные молекулы излучают энергию,
до этого поглощенную ими во время периода облучения. Под
люминесценцией (Л) понимают испускание фотонов веществом
в электронно-возбужденном состоянии. В зависимости от
природы основного и возбужденных состояний Л делится на два
типа. В синглетном возбужденном состоянии (суммарный
электронный спин данного состояния s
=0) электрон на
энергетически более высокой орбитали и второй электрон на
орбитали с более низкой энергией имеют противоположную
ориентацию спинов, т.е. спины этих электронов спарены. В
триплетном (суммарный электронный спин данного состояния
s
=1) состоянии эти электроны не спарены, т.е. их спины имеют
75
одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из
возбужденного синглетного состояния в основное ориентация
его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина
необходимо при переходе из триплетного состояния в
синглетное основное состояние. Флуоресценция - это
испускание, происходящее при возвращении спаренного
электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы
квантовомеханически "разрешены", а типичные величины
времени жизни для них примерно 10-8 сек (10 нс). Время жизни это средний период времени, в течение которого флуорофор
находится в возбужденном состоянии.
В соединениях, проявляющих значительную
флуоресценцию, электроны в основном делокализованы и
формально расположены на сопряженных двойных связях.
Большое количество молекул органических веществ являются
природными флуорофорами. К ним, например, относятся
полициклические ароматические углеводороды (бензпирены,
антрацен, нафталин и др.). Одним из широко распространенных
флуорофоров является хинин, который добавляют в
тонизирующие напитки. Его присутствие можно заметить по
слабому голубому свечению, если смотреть на стакан тоника,
выставленный на солнечный свет.
Природными флуорофорами являются белки. Триптофан наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокислота в белках.
Менее интенсивно флуоресцирует тирозин. Наконец,
естественные красители, присутствующие в винах, обладают,
как правило, высокими флуоресцентными свойствами.
Часто естественные флуоресцентные свойства молекул,
входящих в состав пищевых продуктов, не позволяют проводить
чувствительные определения. Для повышения флуорофорных
свойств (повышения квантового выхода) органических веществ
используют флуоресцирующие реагенты. Наиболее часто
используемые реагенты - изоцианаты, диметиламинобензол
76
(нафталин) сульфохлориды, нафтиламиносульфоновые кислоты
и другие соединения.
Флуоресцентные спектральные данные обычно
представляют в виде спектров возбуждения (поглощения) и
спектров испускания (эмиссии) определяемых веществ.
Спектр поглощения вещества используется для выбора
характерных для данного соединения условия возбуждения
флуоресцентных спектров. Спектр испускания флуоресценции, в
свою очередь, представляет собой зависимость интенсивности
флуоресценции от длины волны. Эта спектральная зависимость
используется для выбора оптимальных условий регистрации
флуоресценции.
Флуоресцентные детекторы характеризуются более
высокой селективностью, чем спектрофотометрические,
поскольку не все молекулы, способные поглощать свет, могут и
излучать его. ФЛ детекторы оказываются более
чувствительными из-за низкого фонового шума. Большинство
ФЛ детекторов имеют такую конструкцию оптической системы,
в которой возбужденный свет от ксеноновой импульсной лампы
регистрируется под углом (часто под прямым углом) к
падающему свету. Этим снижается вероятность, что рассеянный
падающий свет может создавать помехи как фоновый сигнал, а
также гарантируется максимальное отношение сигнала к шуму,
необходимое для чувствительного обнаружения интересующих
веществ.
До недавнего времени ФЛ детекторам был присущ
недостаток, связанный с продолжительным периодом прогрева
лампы и дрейф, связанный с теплопередачей. В современных
конструкциях используются импульсные лампы, работа которых
протекает в импульсном режиме. При работе с такими лампами
не наблюдается влияния процессов теплопередачи, приводящих
к дрейфу сигнала.
77
Электрохимические (ЭХ) детекторы
К электрохимическим детекторам относят устройства,
откликающиеся на изменения свойств веществ в объеме
раствора при регистрации сигнала на границе раздела фаз
твердый электрод - раствор. К этой группе относят
кондуктометрический детектор, широко используемый в ионной
хроматографии. В ВЭЖХ органических веществ более широкое
применение нашли вольтамперометрический (измерение силы
тока как функции приложенного потенциала) и
потенциометрический (измерение эдс цепи при отсутствии тока)
детекторы. По временной зависимости приложенного
потенциала вольтамперометрические детекторы разделяют на
амперометрические (при постоянном потенциале), импульсные
амперометрические (когда два или три значения потенциала
меняются скачкообразно с быстрой скоростью) и сканирующие
амперометрические (при уменьшении или возрастании
потенциала) детекторы. Близким к амперометрическому
является кулонометрический детектор, характеризующийся
требованием 100%-ой эффективности по току реакции на
электроде. Амперометрический детектор оказался наиболее
удачным по своей конструкции среди других используемых
ЭХД.
Возможность использования ЭХД-ВЭЖХ ограничивается
сравнительно небольшим кругом органических веществ
(нитросоединения, амины, фенолы, гидразины и др.). Основные
классы органических соединений, особенно алифатического
ряда, не проявляют электрофорных свойств и не регистрируются
электрохимическим методом. В то же время они могут быть
зафиксированы универсальным спектрофотометрическим
детектором. Этот факт, наряду с выбором рабочих условий
детектирования (потенциал электрода и др.), в значительной
степени определяет селективность отклика ЭХД при анализе
78
матриц сложного состава, одновременно ограничивая
возможности использования ЭХД-ВЭЖХ. Тем не менее
существуют возможности для расширения классов органических
веществ, пригодных для определения методом ЭХД-ВЭЖХ.
Одним из главных способов является пред- или постколоночная
химическая дериватизация с использованием хорошо изученных
органических реакций ацилирования, дансилирования и др. При
этом достигаются две основных цели: повышение
чувствительности (появление отклика) детектора за счет
введения в определяемые соединения электрофорных групп;
повышение избирательности отклика детектора за счет
проведения селективных (специфических) реакций,
упрощающих проведение определений в матрицах сложного
состава.
Другим важным фактором регулирования селективности и
расширения возможностей ЭХД стало использование
электрокаталитически активных электродных материалов. В
этом случае электрод выступает не просто как инертный
материал, на котором происходит обмен электронами
(например, при окислении вещества), но он сам является
участником электрохимической реакции.
Для этих целей
используют металлические электроды, способные образовывать
на поверхности слои оксидов (гидроксидов) с различными
электрокаталитическими свойствами. Следствием таких свойств
электродов является тот факт, что вольтамперометрический
сигнал для различных веществ определенного класса
регистрируется при одних и тех же значениях потенциала, но
отклик сильно зависит от потенциала, необходимого для
перевода электрода в определенное каталитическое состояние. В
зависимости от электродного материала, в ЭХД используются
амперометрия при постоянном потенциале или импульсная
амперометрия.
79
Для изготовления рабочих электродов для ЭХД
используют различные материалы, но наибольшее применение
нашел стеклоуглеродный электрод. Кроме того, используют
металлические электроды: золотой (для определения сахаров и
спиртов), платиновый (пероксид водорода, гидразин, сульфиты),
серебряный (галогениды), медный (аминокислоты), ртутный
(электровосстановление тиосульфата), амальгамный золотой
(для электровосстановления нитрозамещенных органических
соединений)
Кроме того, используют металлические электроды,
способные образовывать на поверхности слои оксидов
(гидроксидов) с различными электрокаталитическими
свойствами. Следствием таких свойств электродов является тот
факт, что вольтамперометрический сигнал для различных
веществ определенного класса регистрируется при одних и тех
же значениях потенциала, но отклик сильно зависит от
потенциала, необходимого для перевода электрода в
определенное каталитическое состояние. В зависимости от
электродного материала, в ЭХД используются амперометрия
при постоянном потенциале или импульсная амперометрия.
Одной из главных проблем ЭХД является изменение свойств
поверхности собственно детектора - электрода за счет
необратимой адсорбции органических веществ и/или продуктов
их окисления. Это вызывает изменение пределов обнаружения
(ПрО) в ходе нескольких последовательных операций ввода
пробы порой на 3-4 порядка, ухудшает воспроизводимость и
другие характеристики детектора. В свою очередь, такая
проблема в принципе не характерна для конкурентных систем
детектирования, в том числе для сопоставимого по
селективности и чувствительности флуоресцентного (ФЛД)
детектора.
Для постоянной регенерации свойств рабочего электрода
нашло применение импульсное амперометрическое
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]