Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы исследования качества продуктов питания. Учебное пособие
.pdf
сил растворитель движется вдоль слоя сорбента до финиша и с
x
y
ф р он т
ст а рт
разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к
их разделению. Принцип разделения такой же, как в других
видах хроматографии - неодинаковое сродство разделяемых
органических веществ к подвижной жидкой фазе и
стационарному сорбенту. После достижения растворителем
(элюентом) линии финиша пластинку высушивают и проводят
идентификацию компонентов. Разделенные компоненты на
пластинке или полоске бумаги образуют отдельные зоны (пятна)
(рис.3.13). Многие вещества не обнаруживаются в видимой
области и для их определения невидимые зоны проявляют
опрыскиванием пластины ТСХ специальными реагентами. Для
обнаружения пятен можно использовать УФ-излучение или
термическую деструкцию веществ.
Рис.3.13. Схема анализа
методом ТСХ. 1анализируемая смесь,
2,3,4 - стандартные
вещества ("свидетели")
1 2 3 4
Важной характеристикой степени разделения
определяемых соединений в планарной хроматографии является
величина R
- отношение расстояния от центра пятна на
f
пластинке до линии старта (х) к расстоянию (у), пройденному
61
растворителем от линии старта до финиша. Величина Rf
является качественной характеристикой определяемого
соединения, хроматографируемого на данном сорбенте, в
данном растворителе и в данных условиях опыта. Для
надежности идентификации веществ при определении Rf часто
используют "свидетели". Для этого на пластинке вместе с
разделяемой смесью веществ хроматографируют стандартные
вещества ("свидетели").
В зависимости от направления движения растворителя и от
положения пластинки с сорбентом различают восходящую,
горизонтальную и нисходящую тонкослойную хроматографию.
В методе восходящей хроматографии растворитель
поднимается по пластинке снизу вверх под действием
капиллярных сил, которые преобладают над гравитационными
силами. Здесь действуют также и силы диффузии, влияющие на
перемещение хроматографируемого вещества как в продольном,
так и в поперечном направлении. Продвижение растворителя на
пластинке с закрепленным слоем сорбента обычно не должно
превышать 10-12 см, так как в противном случае наблюдается
замедление движения фронта растворителя, диффузия пятен и
большие колебания R
. Метод нисходящей хроматографии
f
характеризуется подачей растворителя на пластинку сверху
вниз. При горизонтальной хроматографии пластинка в камере
расположена строго горизонтально.
Выбор хроматографической системы. Правильный
выбор сорбента и растворителя (смеси растворителей)
определяет эффективность (полноту) разделения. Выбор
хроматографической системы определяется природой
анализируемой смеси. В ТСХ наибольшее применение в
качестве сорбентов получили силикагели и окись алюминия.
Кроме них используют кизельгур, целлюлозные порошки,
полиамидные сорбенты, сефадекс, гидроокись кальция, силикат
магния, различные модифицированные сорбенты. Выбор
62
сорбента определяется свойствами разделяемых соединений, их
растворимостью (гидрофильность, гидрофобность),
содержанием и характером функциональных групп. Например,
насыщенные углеводороды сорбируются в очень малой степени
и поэтому движутся в сорбенте с более высокой скоростью. Для
их разделения следует использовать наиболее активные
сорбенты и малополярные растворители. Ненасыщенные
углеводороды сорбируются тем сильнее, чем больше в них
содержится двойных связей. Для органических веществ,
содержащих разные функциональные группы, адсорбционное
сродство повышается в следующем ряду -СН
, -ОН, -СООН. Это приводит к тому, что на слоях
NH
2
, -О-аlk, >С=О, -
3
силикагеля или окиси алюминия при применении в качестве
растворителя, например, бензола простые или сложные эфиры
располагаются в верхней части хроматограммы, кетоны и
альдегиды примерно в середине, спирты ближе к линии старта, а
кислоты остаются на старте.
Растворители разной природы, используемые в ТСХ,
различаются по их элюирующему (вытеснительному) действию
и их можно расположить в так называемые элюотропные ряды.
Наблюдается очевидная зависимость между полярностью и
элюирующим действием растворителя. Например, элюотропный
ряд для силикагеля по мере возрастания элюирующей
способности выглядит следующим образом: н-гексан, пентан,
циклогексан, четыреххлористый углерод, толуол, хлороформ,
дихлорметан, диэтиловый эфир, уксусная кислота, этанол,
метанол, пиридин, вода.
Подвижная фаза должна быть достаточно летуча и
обладать минимальной вязкостью. Рекомендации по выбору
сорбента и подвижной фазы в самом общем виде можно
сформулировать следующим образом. Если вещество обладает
слабым сродством к сорбенту, то используют активные слои и
слабо полярные растворители, стоящие в начале элюотропного
63
ряда и, наоборот, если вещество сильно сорбируется сорбентом,
то применяют слабоактивные сорбенты и сильно полярные
растворители.
Методы обработки хроматограмм. Для получения
информации о качественном и количественном составе
анализируемой смеси используют как химические, так и
физические методы детектирования. В последние годы
значительно возросло использование ферментативных методов,
особенно в клинической диагностике, при определении
пестицидов. Пластинки ТСХ выполняют роль дискет, с которых
химическая, физическая или ферментативная информация
может быть считана в любом месте и в любое время. Все это, в
отличие от других вариантов хроматографии, происходит
отдельно от процесса разделения и этим устраняется влияние
подвижной фазы. Отсюда следует, что селективность
(избирательность) метода ТСХ складывается из селективности
процесса разделения и специфичности детектирования.Это
преимущество присуще только методу ТСХ.
Идентификацию веществ (качественный анализ) можно
проводить по равенству значений R
анализируемого вещества
f
и стандарта ("свидетеля"). Если на хроматограмме образуются
окрашенные зоны, то это значительно упрощает ее обработку.
Невидимые хроматограммы проявляют (находят зоны
разделенных веществ) химическими и физическими способами.
При химическом способе пленку или бумагу опрыскивают
раствором или держат в парах взаимодействующего с
компонентами анализируемой смеси реагента. Эти реактивы
подразделяют на два типа: 1) реактивы общего назначения,
позволяющие обнаружить большое число соединений
различных классов; 2) более специфичные реактивы,
позволяющие обнаружить соединения определенного класса или
с определенной функциональной группой. К реагентам общего
назначения относятся концентрированная серная кислота,
64
раствор бихромата калия в концентрированной серной кислоте,
Альдегиды
1% спиртовый раствор йода, фосфорно-молибденовая кислота,
родамин и другие. Одно из существенных преимуществ ТСХ, по
сравнению с бумажной хроматографией,– возможность
использования агрессивных проявителей.
Примеры специфичных реагентов-проявителей для
обнаружения различных классов органических соединений
приведены в табл.3.5.
Таблица 3.5. Реагенты для обнаружения некоторых
органических соединений
Класс
соедине-
Реагент Окраска пятен
ний
Кислоты Бромкрезоловый
зеленый
Спирты Церийаммонийнитрат
8–Оксинолинат
ванадия(V)
2,4–Динитро-
фенилгидразин
Зеленое пятно на зеленом
фоне
Коричневое пятно на
зеленом фоне
Красное пятно на
зеленом фоне
От желтого до красного
на бледно-оранжевом
фоне
Амины Тиоцианат кобальта
4-хлор-5,7-
динитробензофуразан
Голубое пятно на розовобелом фоне
оранжево-красные,
зеленые, синие пятна на
желтом фоне
Примером селективного реагента, позволяющего
визуально по окраске пятен обнаруживать присутствие
аминосоединений различной природы в смесях, является 4-хлор-
5
,7-динитробензофуразан
65
2
O2N
O2N
NH-NH
NO
2
2
N
O2 N
O
N
Cl
N
+
N2H
NO
O
4
N
2
HCl
2
O
N
N
NHNH
NO
2
O2 N
O
N
N
NO
4-хлор-5,7-динитробензофуразан
При физическом способе проявления зон пластинку
облучают УФ-излучением. Сорбент обычно содержит
флуоресцентные индикаторы (силикаты цинка, сульфиды цинка
или кадмия, вольфраматы щелочноземельных металлов) и
пластина при облучении светится бледно-голубым светом. Если
на пластинке есть вещества, способные поглощать УФизлучение (ароматические и содержащие сопряженные С=С
связи вещества), то происходит ингибирование флуоресценции.
Поэтому на ярком фоне пластинок появляются темные зоны,
соответствующие определяемому соединению.
.4 ДЕТЕКТОРЫ В ХРОМАТОГРАФИИ
3
В ВЭЖХ используют два основных принципа
детектирования.
Измерение какого-либо общего свойства подвижной
фазы, например, показателя преломления или
электропроводности. Этот способ детектирования является
неселективным и поэтому универсальным.
Измерение какого-либо специфического свойства
разделяемых веществ – светопоглощения в видимой и УФобласти, интенсивность флуоресценции или сила тока при
электролизе вещества на рабочем электроде. Наибольшее
распространение получили спектроскопические детекторы.
Некоторые из них рассмотрим ниже.
66
Для анализа пищевых продуктов и продовольственного
сырья может использоваться большинство современных
детекторов. Каждый детектор имеет свои преимущества и
недостатки. Например, детекторы с диодной матрицей и массспектрометры предоставляют дополнительную спектральную
информацию, но их применение увеличивает затраты на анализ.
Возможность пользоваться спектральной информацией для
подтверждения наличия конкретных веществ в анализируемой
смеси, а также их метаболитов и производных в пищевых
продуктах делает спектрофотометрические детекторы наиболее
популярными. При решении задач, требующих повышенных
чувствительности и селективности, полезно использование
флуоресцентного детектора. Несмотря на то, что повышение
чувствительности и селективности обнаружения наблюдается и
при пользовании электрохимическими (амперометрический и
кулонометрический) детекторами, при анализе пищевых
продуктов эти детекторы используются реже.
Кондуктометрический детектор пригоден для чувствительного и
селективного анализа катионов и анионов.
Рефрактометрический детектор используется только тогда,
когда упомянутые выше детекторы непригодны для анализа.
Наиболее важными параметрами при хроматографическом
анализе являются предел обнаружения, интервал и нижняя
граница определяемых содержаний, линейность градуировочной
зависимости, селективность и способность получения
качественной информации.
Предел обнаружения и границы определяемых содержаний
зависят от фонового сигнала, дрейфа базовой линии.
Характеризующий детектор абсолютный предел обнаружения
можно установить благодаря введению вещества
непосредственно в детектор. Этот предел обнаружения часто
определяют по минимально обнаруживаемому уровню
концентрации и приравнивают к уровню шума. Однако предел
67
обнаружения зависит не только от детектора, но и от
содержания кислорода в подвижной фазе, эффективности
устройства ввода образца, размывания пика в колонке, разницы
в температуре различных узлов хроматографической системы.
Чтобы учесть все эти факторы, принято считать, что предел
обнаружения должен оказываться в 2-3 раза выше уровня шума
(3σ критерий). Граница, допускающая возможность
количественного анализа, в 10-20 раз выше уровня шума.
Спектрофотометрические детекторы имеют предел
обнаружения свыше 500 пкг вещества. Предел обнаружения
может достигать 100 пкг при анализе таких компонентов
пищевых продуктов, как антиоксиданты. Флуориметрический и
электрохимический детекторы дают возможность обнаруживать
концентрации на уровне единиц пкг. Предел обнаружения массспектрального детектора ВЭЖХ зависит от типа используемого
устройства сопряжения и достигает пкг. Рефрактометрические
детекторы позволяют регистрировать концентрации свыше 500
нг.
Селективность - это способность системы обнаруживать в
сложной матрице только интересующие вещества (реагировать
на специфические свойства вещества). Детектор считается
селективным, если он не регистрирует присутствующие в пике
посторонние вещества, которые могли бы помешать получению
количественной информации о конкретном химическом
соединении. Селективности спектрофотометрического
детектора можно добиться за счет настройки на
соответствующую длину волны с узкой шириной полосы.
Однако селективность спектрофотометрических детекторов
ниже по сравнению с флуоресцентным и электрохимическим
детекторами. Масс-спектрометры могут быть настроены на
режимы селективного или универсального обнаружения.
Универсальное обнаружение обеспечивается в режиме
68
сканирования ионов. Рефрактометрические детекторы не
селективны.
Отклик детектора характеризуется динамическим
диапазоном и линейным динамическим диапазоном.
Динамический диапазон определяется отношением
максимальной и минимальной концентрации, при которых
регистрируется контролируемый показатель (абсорбция, ток и
т.д.). На практике более важна другая характеристика детектора
- «линейный динамический диапазон» (диапазон концентрации
веществ, в котором отклик детектора линеен). Часто область
линейного отклика составляет только 1/10 от полного
динамического диапазона. Спектрофотометрические детекторы
имеют протяженность линейного диапазона не более 5 порядков
амплитуды; флуориметрический и электрохимические – чуть
более 2 порядков амплитуды. Отклик масс-спектров линеен в
диапазоне свыше 3 порядков амплитуды; рефрактомерических
детекторов – в диапазоне не более 4 порядков амплитуды.
Классическим средством распознавания информации в
хроматографии является масс-спектр, регистрируемый массспектрометром. Однако использование такого подхода к
регистрации веществ в ВЭЖХ ограничено высокой стоимостью
устройств сопряжения хроматографа с масс-спектрометром.
Если спектры определяемых веществ существенно
различаются, для распознавания можно пользоваться
детекторами с диодной матрицей. Флуориметрический и
электрохимический детекторы дают возможность
идентификации веществ только по времени удерживания.
Спектрофотометрический детектор
Оптическая система традиционного спектрофотометрического (СФ) детектора показана на рис. 3.14 .
69
Дифракционная
Монохроматор
Зеркало
Раствор сравнения
Щель
решетка
Программируемая щель
Анализируемый раствор
Дейтериевая лампа
Детектор
Рис. 3.14 . Традиционная оптическая система спектрофотометра с изменяемой длиной волны
Полихроматический свет от дейтериевой лампы
фокусируется на входную щель монохроматора сферическим
или плоским зеркалом. Монохроматор избирательно пропускает
узкую спектральную полосу света на выходную щель. Луч
света, прошедшего через выходную щель, проходит через
проточную кювету, где свет частично поглощается имеющимся
в кювете раствором. Поглощение света образцом
регистрируется за счет измерения интенсивности света,
попадающего на фотодиод при отсутствии образца (контроль), и
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]