Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы исследования качества продуктов питания. Учебное пособие
.pdf
Флуоресцентные методы широко применяют в
физических, биохимических, медицинских и химических
исследованиях. Причиной этого служат присущая этим методам
высокая чувствительность, а также удобный временной
диапазон испускание флуоресценции. За этот промежуток
времени происходит множество различных молекулярных
процессов, которые способны повлиять на спектральные
характеристики флуореcцирующего соединения. Такое
сочетание чувствительности с подходящим временным
диапазоном способствует тому, что флуоресцентные методы
используют для изучения и мембран, их взаимодействий с
другими макромолекулами.
Можно выделить основные области практического
использования флуоресцентной спектроскопии:
• Это один из основных методов в биохимических
исследованиях, например, при исследовании эффектов памяти
человека по содержанию в биосубстратах флуоресцирующего
допамина;
• По флуоресцентным свойствам проводится
обнаружение и определение содержания токсичных,
канцерогенных веществ (нитрозоаминов, полициклических
ароматических углеводородов, афлатоксинов и др. веществ) в
воде, пище, воздухе;
• Флуоресцентные маркеры (метки) используют для
установления направления и скорости движения подземных вод,
засоления почв пластовыми водами в районах нефтедобычи,
определения повреждений подземных продуктопроводов и
городских коммуникаций.
• Флуоресцентными маркерами метят нефть,
нефтепродукты, перевозимые танкерами, чтобы затем можно
было опознать источник загрязнения Мирового океана.
141
4.3 МЕТОД ЯДЕРНО-МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА
Явление ЯМР заключается в резонансном поглощении
электромагнитного излучения, обусловленного магнетизмом
ядер. Ядро – заряженная частица, обладающая механическим
моментом, при движении оно создает собственный магнитный
момент.
Под резонансом понимают возрастание амплитуды
установившихся вынужденных собственных колебаний
системы, когда частота
νννν
внешних воздействий на
колебательную систему приближается к какой либо из частот ее
собственных колебаний. ЯМР – это спектроскопический метод,
-2
в котором используется ЭМИ с высокими (10
– n 10-2 Мгц)
частотами, радиоволновое излучение. Разность энергий уровней
и энергия квантов ЭМИ, участвующих в этих процессах,
составляет около 10-7 эВ. Эта разница в энергии связана с
различной ориентацией магнитных дипольных моментов ядер в
приложенном магнитном поле.
Под влиянием внешнего магнитного поля магнитные
моменты ядер (электронов) ориентируются определенным
образом. Это происходит в соответствие с квантовой природой
углового момента ядра, принимающего 2J + 1 значение.
Спиновое квантовое число (спин) I может принимать любое
значение, кратное ½. Например, для изотопа 71Lu
176
I ≥≥≥≥ 7.
Сущность метода ЯМР можно проиллюстрировать
следующим образом. Поместим ядро в постоянное магнитное
поле с напряженностью Н
ядра после появления поля Н
, направленного по оси Z. Энергия
0
будет равна E = -
0
µµµµ
Н0. В
результате взаимодействия магнитного момента ядра с
магнитным полем Н
который вызывает прецессию вектора
поля Н
под постоянным углом ΘΘΘΘ (рис. 4.16). Под прецессией
0
частица получает вращательный момент,
0
µµµµ
вокруг направления
142
понимается движение оси собственного вращения,
вращающегося около неподвижной точки, при котором ось
описывает круговую коническую поверхность.
Рис. 4.16. Прецессия магнитного поля М парамагнетика в
постоянном магнитном поле Н0
Такая прецессия создает переменный магнитный момент
µ
sinΘ . Он вращается в плоскости XY с частотой γH
перпендикулярно направлению поля Н
143
.
0
0
Если в той же плоскости XY в том же направлении
вращается переменное магнитное поле Н1 с частотой
ω
, то оно
1
будет взаимодействовать с переменным магнитным моментом
µ
sin
Θ
. Это взаимодействие будет тем сильнее, чем ближе
частота
ω
При
к частоте
1
ω
=
1
ω
.
L
ω
наступает резонанс, сопровождающийся
L
поглощением энергии переменного магнитного поля Н1.
Под действием вращательного момента, создаваемого
полем Н0, магнитный момент совершает круговые вращения по
образующей конуса с ларморовской частотой
ω
L
=
γ
H
. При
0
наложении переменного магнитного поля, вектор
напряженности которого Н
совершает круговое движение с
1
ларморовской частотой в плоскости, перпендикулярной вектору
Н0, происходит изменение угла прецессии, приводящее к
опрокидыванию магнитного момента М. Увеличение угла
прецессии
магнитного поля, уменьшение
Θ
сопровождается поглощением энергии электро-
Θ
- излучением с частотой
ω
L
.
В магнитном поле происходит расщепление уровней
энергии ядра (эффект Зеемана) (рис.4.17).
.
Рис. 4.17. Зеемановское расщепление уровней энергии ядра в
магнитном поле
144
Частота
ωωωω
электромагнитного поля, которая вызывает
переходы между соседними уровнями, определяется
выражением
ωωωω
= -µ Н0/Ih (4.14)
Условие перехода
резонанса, где g спектроскопический фактор расщепления,
∆∆∆∆
E = g
ββββ
H
соответствует условию
I
0
ββββ
-
магнитный момент ядра (ядерный магнетон).
При поглощении энергии нарушается термодинамическое
равновесие в системе спинов. В равновесное состояние система
возвращается за счет безизлучательных переходов (за счет
релаксационных процессов).
Различают два типа релаксационных процессов:
спин-решеточная (продольная) релаксация;
-
- спин-спиновая (поперечная) релаксация.
Спин-решеточная релаксация связана с передачей энергии ядер
окружающей среде (решетке) и превращением ее в тепловую
энергию. Она характеризуется временем релаксации Т1. Чем
больше время релаксации, тем меньше разность заселения
уровней и, следовательно, меньше интенсивность сигнала.
Спин-спиновая релаксация заключается в обмене энергии
между спинами частиц. В ходе этого процесса ядра атомов с
высокой энергией передают часть своей энергии ядрам других
атомов, имеющих более низкие энергетические состояния. Она
характеризуется временем Т2.
Для экспериментального наблюдения резонансного
поглощения используют две возможности:
- варьируют частоту
- меняют Н0 при сохранении постоянной
ωωωω
поля Н1 при постоянном поле Н0;
1
ωωωω
.
1
На рис. 4.18 представлена схема установки спектрометра
ЯМР.
145
Рис.4.18. Схема установки спектрометра ЯМР: 1-генератор
электромагнитного излучения; 2-волновод; 3- резонатор, 4магнит, 5-детектор электромагнитного излучения, 6усилитель сигнала ЯМР, 7- регистрирующие устройства
(осциллограф, ЭВМ)
В результате сканирования Н0 записывается сигнал спектр ЯМР.
Площадь спектральной линии пропорциональна числу
резонирующих ядер, что положено в основу количественного
анализа.
Ширина спектральной линии для растворов исследуемых
веществ составляет 0,1 – 1 Гц (ЯМР высокого разрешения). В
твердой фазе эти же ядра имеют ширину порядка 104 Гц (ЯМР
широких линий).
Около 130 известных изотопов различных атомов
элементов имеют магнитные моменты и пригодны для изучения
методом ЯМР. Однако только меньшая их часть используется
для исследований. Почти 90% ЯМР-исследований проводят на
1
ядрах
Н и
19
F. Это связано с тем, что они обладают:
146
- высоким естественным содержанием (содержание изотопа 1Н
составляет 99,98%);
- большим магнитным моментом;
- их спин I = ½.
Это обуславливает чувствительность метода ЯМР.
В спектроскопии ЯМР высокого разрешения основными
источниками информации об исследуемом веществе являются:
- химический сдвиг;
- константы спин-спинового взаимодействия.
Химический сдвиг
Резонирующие ядра, сигналы которых записываются в
ЯМР, являются составной частью молекул и окружены
электронной оболочкой. При помещении исследуемого
вещества в магнитное поле возникает диамагнитный момент
атомов (или молекул). Он обусловлен орбитальным движением
электронов. Движение электронов создает эффективные токи и
образует вторичное магнитное поле. Напряженность этого
вторичного поля пропорционально напряженности
приложенного поля Н
и противоположно по направлению.
0
Таким образом происходит экранирование ядра вторичным
полем Н.
Н = Н0 (1-σ), (4.15)
где σσσσ - безразмерная постоянная экспонирования. Она не
зависит от Н0 и зависит от химического (электронного)
окружения исследуемого ядра. При этом σσσσ - характеризует
уменьшение напряженности поля, действующего на ядро, по
сравнению с Н0 приложенного поля.
Величина σσσσ может меняться от 10
-5
(для протона) до 10-2 для
тяжелых ядер.
147
Эффект экранирования заключается в уменьшении уровней
ядерной магнитной энергии и выражается в сближении
Зеемановских уровней (рис 4.19).
Рис. 4.19.Влияние электронного экранирования на Зеемановские
уровни ядра. а – неэкранированное ядро, б – экранированное ядро
При этом кванты энергии, вызывающие переходы между
уровнями, становятся меньше по величине. Это означает, что
при достижении резонанса напряженность приложенного поля
должна иметь большую величину по сравнению с тем случаем,
когда ядро экранировано. Из этого вытекает, что ядра одного и
того же сорта в зависимости от химического окружения будут
неэквивалентны. Для этилового спирта, например, в молекуле
имеется три типа неэквивалентных протонов: 3 протона
метильной группы, 2 метиленовой группы и 1 гидроксильный
протон. Поэтому в спектрах ПМР регистрируются 3
спектральных линии, соответствующих этим группам, их
соотношение выражается как 1 : 2 : 3 (рис. 4.20).
Рис. 4.20. Спектр протонного резонанса этилового спирта,
снятый при низком разрешении
148
Такое смещение сигнала одного и того же ядра в
зависимости от химического окружения называют химическим
сдвигом. Оно обусловлено различием в констанах
экранирования.
Химические сдвиги нельзя измерить в абсолютной шкале,
так как нет ядра, лишенного всех электронов. Поэтому в
качестве условного 0 используют сигнал эталонного соединения
– тетраметилсилана Si(CH3)4. Обычно химические сдвиги для
разных ядер приводятся в виде безразмерной величины
δ
= (Н – Нэт)/Н
эт
6
×
10
(4.16)
За единицу химического сдвига принята 1/миллионная
доля напряженности магнитного поля или резонансной частоты
(м.д.). Химический сдвиг зависит от типа ядра и для изотопа
59
Со составляет 20000 м.д. Для 1Н величина δ составляет
обычно от 0 до 10 м.д. Для воды он равен примерно 2 м.д.
Спин-спиновое взаимодействие
В спектрах ЯМР многих веществ часто обнаруживается
больше линий, чем это можно было бы ожидать из оценки числа
неэквивалентных ядер, например POCl2F. На ядрах 19F при ЯМР
–исследованиях обнаруживается 2 сигнала (дуплет), хотя в
молекуле имеется только один атом фтора (рис.4.21).
Рис. 4.21. Дуплет в спектре резонанса на ядрах фтора в
молекуле POCl
F
2
Другие соединения могут давать мультиплетные сигналы
(триплет, квартет и др.).
149
Другая особенность этих мультиплетных сигналов это то,
что расстояние между этими линиями, измеренное в частотной
шкале (νννν), не зависит от напряженности приложенного поля.
Этот эффект обусловлен механизмом косвенной связи ядер
через электронное окружение. Ядерный спин стремится спины
электронов, окружающих данное ядро. Электроны, в свою
очередь, ориентируют спины других электронов и через них –
спины других ядер. Энергия спин-спиновых взаимодействий
обычно выражают в Гц. Величину этих взаимодействий
определяют, измеряя расстояние между линиями компонентов
соответствующей мультиплетности (константы спин–спинового
взаимодействия, КССВ).
Константы спин–спинового взаимодействия
Спин-спиновое взаимодействие J
можно представить
AX
следующей схемой (рис.4.22.). Пусть имеется 2 ядра одного и
того же сорта А и Х, имеющих различающиеся химические
сдвиги. Пусть спины ядер равны I = ½.
Рис. 4.22. Вид спектра ЯМР системы, состоящей из магнитных
ядер А и Х со спином I = ½ при выполнении условия
δδδδ
>>>>
JAX
АХ
Каждое ядро расщепляет резонансные линии соседнего
ядра на 2
I+1 (то есть на 2××××½ + 1 линии).
В том случае, когда имеется N эквивалентных (то есть
одинаково экранированных, имеющих одинаковый химический
150
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]