Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы исследования качества продуктов питания. Учебное пособие
.pdf
реакционноспособных групп, таких как -NH
, -OH, -COOH, -SH.
2
Например, сшивка фермента может протекать по реакции
E-NH
+ HOOC-Aг →→→→ E-NH-CO-Aг + Н
2
О.
2
В тех случаях, когда невозможно прямое взаимодействие,
используются бифункциональные сшивающие реагенты
(глутаровый диальдегид, n-бензохинон). Часто используют
прием активирования функциональных групп. Гидроксигруппы
в углеводном компоненте пероксидазы хрена, например, можно
окислить с помощью периодата натрия до альдегидных. Сшивка
модифицированной пероксидазы с антигеном или антителом
происходит затем с участием альдегидных групп с образованием
оснований Шиффа
-CHO + H
E
N-Аг →→→→ E-CH=N-Аг +Н+ →→→→ E-CH=N
2
+
H-Аг
Иммунологические методы получения меченых
ферментами антигенов или антител основаны на применении
антител или их составляющих в качестве сшивающих звеньев. В
методе гибридных антител для сшивки антигена с ферментом
проводят поэтапное получение фрагментов к антигену и
ферменту обработкой соответствующих антител пепсином, их
разъединения восстановлением дисульфидных связей
меркаптоэтанолом, смешивание фрагментов, связывающих
антиген, удаление меркаптоэтанола диализом, которое приводит
затем к реассоциации с образованием гибридных фрагментов,
связывающих антиген и фермент в единый комплекс.
Генноинженерный метод получения меченого антигена
основан на синтезе гибридных белков с помощью микроорганизмов.
При количественном ИФА, проводимого либо по
продуктам реакции (Аг-Ат∗ или Аг∗-Ат) или субстратам
∗
реакции, оставшимся в свободном состоянии (Ат
, Аг∗), для
разделения свободного и связанного реагента, меченного
ферментом, используют два основных подхода. В гомогенном
(жидкофазном) варианте ИФА используется направленное
211
воздействие на ферментативную активность комплекса Аг-Е
х
S
S
х
посредством связанного Ат, приводящее к возрастанию или
торможению ферментативной реакции. Этот вариант
реализуется без предварительного физического разделения
меченых реагентов (Ат
∗
или Аг
∗
) от их иммунохимических
продуктов реакций.
В гомогенном ИФА антитело, образуя комплекс с
антигеном, подавляет активность связанного с ним фермента
(см. схему ниже). Если комплекс Аг-Е (или меченый Аг∗)
способен катализировать превращение субстрата S в продукт
реакции Р, то комплекс Ат-Аг-S такую способность теряет.
Потеря активности может быть вызвана изменением
конформации молекулы фермента, приводящим к нарушению
структуры его активного центра. Другая причина подавления
ферментативной активности может быть связана с тем, что
антитело закрывает доступ субстрата к активному центру
фермента.
AT
фермент
АГ
+
АГ
АГ
фермент
AT
АГ
Фермент недоступен для
субстрата S.
Фермент неактивен
Фермент доступен для
субстрата S.
Фермент активен
Поскольку с антителом АТ взаимодействует как свободное,
так и связанное с ферментом определяемое вещество, то
212
присутствие свободного, несвязанного с ферментом антигена
вызывает регенерацию связанного Аг∗ за счет конкуренции. Это
приводит к появлению активности фермента
а(Ат-Аг-Е) + вАг ⇒ с(Ат-Аг-Е) + d(Ат-Аг) +е(Аг-Е) +fАг.
Определение вещества можно провести измерением
каталитической активности фермента по отношению к
субстрату S по градуировочной прямой, представляющей собой
линейную зависимость между концентрацией Аг и
ферментативной активностью Аг-Е (Аг∗). Чем выше
концентрация немаркированного определяемого вещества в
анализируемой системе, тем меньше фермента связывается
антителами и тем больше субстрата вступает в ферментативную
реакцию. Существуют и другие модификации гомогенного
ИФА, например, с использованием модуляторов ферментов.
Во втором варианте ИФА происходит физическое
разделение меченого реагента с помощью твердой фазы. В
качестве твердой фазы для связывания меченого реагента
используют стенки сосудов, в которых проводится анализ. Эти
сосуды изготавливают в виде специальных планшетов из
непористых прозрачных полимерных материалов (полистирол,
поливинилхлорид, полиметилметакрилат), имеющих 96 лунок
для проведения реакции. Для увеличения прочности связывания
белков пластик подвергается модификации обработкой
глутаровым диальдегидом, поли-L-лизином, толуол-2,4диизоцианатом. После такой обработки поверхность
приобретает способность к ковалентному связыванию белков.
При ИФА Ат связываются со стенками лунок, избыток
антител смывают буферным раствором. Оставшиеся незанятыми
места связывания на поверхности лунок блокируют
добавлением постороннего белка, например, бычьим
сывороточным альбумином и вновь отмывают избыток белка.
Анализируемый образец, содержащий антиген Аг с неизвестным
содержанием, смешивают с определенным количеством
213
меченого антигена и добавляют к антителам, зафиксированным
на поверхности лунок. При этом Аг и Аг-Е конкурентно
связываются с Ат. Поверхность лунок снова промывается для
удаления несвязанных Аг и Аг-Е. После этого определяется
активность фермента в каждой лунке, которая обратно
пропорциональна концентрации антигена в исследуемом
образце. Результаты ферментативной реакции в 96 лунках
(например, 96 проб крови) спектрофотометр сканирует за
минуту. Такой вариант ИФА называют конкурентным
гетерогенным.
В иммуноанализе используют и потенциометрическое
детектирование, хотя оно менее чувствительно, чем
амперометрическая регистрация аналитического сигнала.
Принцип потенциометрического иммуноферментного анализа
можно проследить на примере определения дигоксина с
использованием СО
-электрода. В этом методе полистироловые
2
шарики покрывают дигоксином и затем проводят конкурентную
реакцию последнего с антителами к дигоксину, меченными
пероксидазой хрена. После этого шарики можно
отцентрифугировать вместе с образовавшимся на их
поверхности комплексом АТ-АГ. Их затем используют для
ферментативной реакции между пирогаллолом и пероксидом
водорода. Образующийся в результате реакции СО2
детектируется потенциометрически. В этом методе
гетерогенного иммуноферментного анализа не используется
ингибирование ферментативной активности. Увеличение
концентрации свободного дигоксина приводит к уменьшению
заполнения поверхности полистирольных шариков ферментной
меткой и к снижению скорости образования диоксида углерода.
Благодаря своей чувствительности и специфичности ИФА
стал ведущим методом анализа при определении вирусных
заболеваний растений, токсичных веществ в продуктах питания
и в организмах, эпидемиологическом обследовании населения,
214
контроле содержания вирусов СПИД и гепатита В в крови,
диагностике заболеваний. ИФА используют также для
определения лекарственных веществ, гормональных препаратов,
пестицидов, гербицидов, наркотических веществ,
полихлорированных бифенилов. Преимуществом иммуноферментного анализа является то, что для определения этих
веществ нужен очень малый объем пробы (до 40 мкл). Это
важно в клинической химии, например, при отборе крови у
пациентов.
215
9. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Молекулярная клиническая диагностика - наука, который
включает в себя определение генов и продуктов их деятельности
– протеинов и нуклеиновых кислот. Она начала бурно
развиваться в начале 70-х годов после фундаментальных
открытий в области молекулярной биологии (создания
моноклональных антител, взаимодействующих только с
определёнными эпитопами (антигенными детерминантами),
изобретения метода гибридизации (разделения нуклеиновых
кислот) на фильтрах (Саузерн-блотт) и полимеразной цепной
реакции (ПЦР)). Эти достижения коренным образом изменили
содержание всей молекулярной клинической диагностики. В
странах ЕЭС и северной Америки метод ПЦР стал одним из
методов установления происхождения и качества пищевых
продуктов.
В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает
особое место. Метод ПЦР поднял лабораторную диагностику на
уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что
позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента
или генетической мутации в любой биотической или
абиотической среде. При этом теоретически может быть
обнаружена всего одна искомая молекула нуклеиновых кислот
(НК) среди миллионов других молекул НК. Области применения
метода ПЦР - общая и частная биология, ветеринария,
фармация, пищевая химия, экология как способ контроля за
качеством объектов окружающей среды и продуктов питания, а
также криминалистика (идентификация личности и отцовства).
Принцип метода ПЦР. В основе метода ПЦР лежит
уникальное свойство нуклеиновых кислот (как ДНК, так и РНК)
их способность к саморепродукции, которая воспроизводится
–
искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго
216
специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем
проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную
последовательность искомой НК. После этого синтезируются
два коротких ДНК-зонда или праймера, которые
комплементарны соответствующим участками НК-мишени.
Праймер – самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий
запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система
для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера,
дезоксирубонуклеотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и
термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных
бактерий Termus aquaticus). Эту реакционную смесь подвергают
повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации
(при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при
охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНКполимеразы) новых нуклеиновых кислот.
Ход ПЦР схематично показан на рис. 9.1, где представлены
три основных этапа собственно амплификации: денатурации,
отжига и синтеза (удлинения) нуклеиновых кислот. Сама
полимеразная реакция проходит автоматически в
программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе),
который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной
смесью в очень короткое время. ПЦР включает в себя три
стадии:
термической денатурации ДНК, т.е. расплетения двойной
-
спирали на отдельные нити;
-происходит естественная репликация ДНК.
Комплементарное достраивание нитей начинается не в любой
точке последовательности ДНК, а только в определенных
стартовых фрагментах, к которым присоединяются короткие
олигонуклеотидные последовательности (праймеры);
- на третьей стадии при помощи особого фермента (Taqполимеразы) происходит достраивание строго определенного
фрагмента ДНК, к которому присоединились праймеры.
217
Рис. 9.1. Принцип полимеразной цепной реакции
Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются
точные копии идентифицируемого участка матричной НК,
повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой
термоциклера. После 30-40 циклов амплификации исходное
количество специфических фрагментов ДНК исследуемой
27
молекулы возрастает в 10
раз.
В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента
нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция
218
приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это
означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза
(полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать
число копий амплифицируемого фрагмента НК в
геометрической прогрессии (рис. 9.2). Течение ПЦР аналогично
естественной репликации НК, но при этом строго фиксированно
искусственно синтезированным праймером.
Рис.9.2. Экспоненциальная амплификация ДНК в ПЦР
Так, если один цикл продолжается примерно 3 минуты, то
менее чем через 2 часа можно получить около миллиарда копий
определяемой последовательности нуклеиновых кислот. Если в
растворе не окажется ни одной молекулы нуклеиновых кислот с
участком, комплементарным внесенным праймерам, даже,
несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других
молекул нуклеиновых кислот, реакция ПЦР не пройдет. После
2
5-30 циклов экспоненциального нарастания продуктов реакции
219
происходит выход на плато из-за истощения трифосфатов,
праймеров и повреждений полимеразы. Поскольку праймеры
физически включаются в концы ампликонов, этим самым
детерминируется продукт ПЦР – фрагмент нуклеиновых кислот.
Кроме того, ДНК-полимераза обладает способностью
выбраковывать (редактировать) ошибочные некомплементарные
нуклеотиды. Этим достигается высокая специфичность
результатов исследования.
Продукты ПЦР, или ампликоны, представляющие собой
участок синтетической нуклеиновой кислоты, ограниченный
праймерами, на конечной стадии ПЦР идентифицируют
методом элетрофореза в геле.
Одним из важнейших критериев диагностической
эффективности любого лабораторного анализа является
показатель «чувствительности». При этом следует различать
аналитическую и диагностическую чувствительность.
Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР,
представляет собой то минимальное количество копий
(геномных эквивалентов-г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре
раствора образца, которое может быть определено данной тестсистемой. Большинство коммерческих амплификационных тестсистем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую
нуклеиновую кислоту, если ее концентрация составляет не
менее нескольких сот копий в 1 мл образца. Например,
аналитическая чувствительность большинства тест-системы для
ВИЧ-1 составляет 300-500 копий ДНК в 1 мл образца.
Диагностическая чувствительность определяется количеством
пациентов с данным заболеванием, дающих истинно
положительные результаты при использовании конкретного
набора и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется
общее положение, определяющее клиническую пригодность
любых лабораторных способов диагностики или тест-систем -
220
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]