Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы исследования качества продуктов питания. Учебное пособие
.pdf
COO
-
+
-
O
-
O
O
COO
-
C O
-
Вторая стадия реакции представляет стадию,
лимитирующую скорость всего процесса. Поэтому общая
скорость реакции пропорциональна концентрации ферментсубстратного комплекса ES.
-OOC CH
2 CH2
сукцинат-ион
Сукцинатдегидрoгеназа
-OOC CH
2 CH2
фумарат-ион
2H
Активный центр фермента
Конкурентные ингибиторы реакции
Фермент Е
O
C
CH
2
Сукцинат-ион
(субстрат S)
CH
2
C
O
-O C CH
O
2
малонат-ион
O
O
-O C C
CH2
оксалоацетат-ион
O
C O-
Активность большинства ферментов подавляется
(ингибируется) при появлении в системе различных химических
веществ. Так, для приведенной выше реакции превращения
сукцинат-ионов подавление активности сукцинатдегидрогеназы
происходит при добавлении в раствор малонат- или
оксалоацетат-ионов. Как видно, их ингибирующее действие
основано на структурном сходстве с сукцинат-ионом. Они тоже
содержат две определенным образом расположенные в
пространстве отрицательно заряженные группы, которые
соответствуют конформации активного центра. Такая
201
комплементарность приводит к конкуренции ингибитора с
субстратом за связывание с активным центром
E + I ↔ EI
При этом ингибитор I, связанный с ферментом в фермент-
ингибиторный комплекс EI, в отличие от субстрата, не
подвергается ферментативному превращению. В то же время
образование такого комплекса приводит к снижению
каталитической активности фермента. Этот эффект понижения
ферментативной активности в присутствии ингибиторов
используется в ферментативном анализе. Влияние
конкурентного ингибирования можно устранить или уменьшить
при повышении концентрации субстрата в растворе.
Ингибирование ферментативных реакций химическими
веществами может быть неконкурентным. В этом случае
ингибитор взаимодействует с ферментом не через активный
центр, а в другом месте белковой структуры. Такое
взаимодействие происходит, например, при комплексообразовании ионов металлов с белком, содержащим
концевые SH-группы. При этом происходит изменение
конформации молекулы фермента (надмолекулярной
структуры). Это приводит к обратимой инактивации его
активного центра. Многие органические соединения могут
выступать как необратимые ингибиторы ферментов.
Неконкурентные ингибиторы могут связываться обратимо как
со свободным ферментом, так и с фермент-субстратным
комплексом. При этом образуются комплексы EI и ESI
+ I ↔ EI
E
ES + I ↔ ESI
Неконкурентное ингибирование наблюдается для
ферментативных реакций в присутствии многих органических
веществ и ионов металлов, которые способны обратимо
связываться со специфическими участками регуляторных
202
ферментов. Это вызывает уменьшение активности их
моль/л
каталитических центров.
Возможность использования ферментативных реакций для
мониторинга химических загрязнителей в пищевых продуктах
основывается на зависимости скорости катализируемой
ферментом реакции от концентрации субстрата S (рис.7.1).
V
0
V
max
1/2 V
max
K
m
[S],
Рис. 7.1. Влияние концентрации субстрата S на начальную
скорость V0, катализируемой ферментом реакции. Km –
константа Михаэлиса-Ментен
Характерная форма кривой насыщения фермента
субстратом математически выражается уравнением МихаэлисаМентен
Vo = (Vmax·[S])/(Km + [S]), (7.1)
где Кm - (константа Михаэлиса-Ментен) определяется как
концентрация специфического субстрата, при которой данный
фермент обеспечивает скорость реакции, равную половине ее
максимальной скорости Vmax.
Графическое представление уравнения Михаэлиса-Ментен
в координатах 1/Vo от 1/[S] показывает возможность
203
количественного определения концентрации конкурентных (а) и
0
1/V
0
неконкурентных (б) ингибиторов (загрязнителей) с
использованием ферментативных реакций (рис. 7.2, а и б)
В случае конкурентного ингибирования, как видно,
семейство прямых при разных концентрациях ингибиторов
пересекаются в одной точке на оси ординат. Кроме того, при
этом максимальная скорость Vmax не изменяется в присутствии
конкурентных ингибиторов.
а
б
[I]
2
1
V
[I]
1
1
V
[I] = 0
K
1/[s]
m
V
max
m
tg α =
max
[I]
2
[I]
1
[I] = 0
tg α =
1/[s]-1/K
K
V
max
Рис. 7.2. Зависимость начальной скорости (Vo) от
концентрации субстрата (S) для конкурентного (а) и
неконкурентного (б) ингибирования. I
>
I
>
I 0
2
1
При неконкурентном ингибировании, напротив,
аналогичные зависимости пересекаются на оси абсцисс, отсекая
на ней отрезок, численно равный 1/Кm. Это означает, что данная
величина не меняется при изменении концентрации ингибитора,
m
204
тогда как величина Vmax уменьшается. Повышение
концентрации ингибитора в обоих случаях вызывает изменение
угла наклона (tgα) прямых. При проведении ферментативной
реакции в оптимальных условиях, когда обеспечивается
линейная зависимость начальной скорости от концентрации
ингибитора, определение последних становится возможным с
использованием обычных для кинетических методов анализа
приемов обработки экспериментальных результатов.
Так, активность фермента уреазы, катализирующей
гидролитическое расщепление мочевины, угнетается в
присутствии различных неорганических и органических
веществ.
N-C(O)-NH2 + H2O
H
2
Уреаза
→
2 NH3 + CO
2
Изменение каталитической активности этого фермента
используют для определения следовых количеств этих
загрязнителей в пищевых продуктах и объектах окружающей
среды. Эта ферментативная реакция используется и при
определении содержания мочевины в крови и моче, что очень
важно при диагностике заболеваний почек.
Специфичным и чувствительным методом детектирования
токсичных фосфорорганических пестицидов в воде, продуктах,
почве, а также боевых отравляющих веществ является
энзиматичекая реакция каталитического гидролиза субстрата
ацетилхолина под действием фермента холинэстеразы
⊕ Холинэстераза ⊕
(CH3)3NCH2CH2OCOCH3 + H
COOH
CH
3
O → (CH
2
NCH2CH2OH +
3)3
Эту каталитическую реакцию используют в биосенсорах
(предел обнаружения зарина, зомана и V
-газа достигает 10
x
-12
М)
или в тест-полосках для определения ФОВ в овощах.
205
8. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на
специфическом связывании определяемого соединения
соответствующими антителами. ИФА обеспечивает
исключительно высокую чувствительность (до 10
-12
М/л) и
селективность при определении гормонов, ферментов,
лекарственных препаратов, вирусов (в том числе вирусов СПИД
и гепатита В), опухолевых и бактериальных антигенов, белков и
других органических веществ. Определять другими методами
эти соединения либо затруднительно, либо практически
невозможно. ИФА широко используют в клинической химии,
сельском хозяйстве, микробиологической и пищевой
промышленности, в экологическом мониторинге.
Принцип иммуноферментного анализа прост и основан на
взаимодействии исследуемого вещества (антигена) со
специфически связывающимся с ним партнером, называемым
антителом. Биологическая функция антител заключается в
защите организма от чужеродных веществ. К ним относятся
специфические белки крови (иммуноглобулины). Иммунный
ответ на появление антигена сопровождается синтезом антител,
различающихся по структуре и функциональному
предназначению. Иммунная система эшелонирована. В ней
существует несколько линий защиты от внедрения антигенов.
Иммуноглобулины (Ig)
классов G, D, E могут связать по две
молекулы антигена (двухвалентны), IgA четырех- или
восьмивалентны, IgM десятивалентны. При появлении в
организме веществ-антигенов, способных вызвать специифические иммунологические реакции в организме (в том числе
биосинтеза специфических антител), иммуноглобулины
образуют с ними прочные специфические комплексы и выводят
их из организма.
206
Антигенами могут быть белки, полисахариды,
липополисахариды, нуклеиновые кислоты, различные
биологические структуры (клетки микроорганизмов, ткани,
вирусы, в том числе вирусы СПИДа). Они называются
полноценными антигенами. Антитела образуются не против
всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к
небольшим участкам на их поверхности, так называемым
антигенным детерминантам (эпитопам). Такие участки у белков
включают не менее пяти аминокислотных остатков. Антигенные
детерминанты разветвленных молекул полисахаридов
представлены цепочками из четырех – шести остатков.
Существуют также неполноценные антигены – гаптены.
Антитела к гаптенам образуются лишь при их иммобилизации
на полимерную матрицу. В качестве такой матрицы
используются белки, полимеры клеточных стенок бактерий,
синтетические полиэлектролиты. Таким образом, можно
получить антитела к антибиотикам и другим лекарственным
соединениям, стероидным и пептидным гормонам, витаминам,
пестицидам, даже таким простым веществам как, 2,4динитрофенол.
Гаптены представлены не только низкомолекулярными
соединениями. Нуклеиновые кислоты сами по себе
неиммуногенны. Однако если они находятся в комплексе с
белками, то происходит синтез антител с нуклеиновыми
кислотами.
Антитела для определения антигенов получают путем
иммунизации животных (мышей, морских свинок, кроликов,
овец, коз, лошадей) соответствующим антигеном. Поскольку
антиген, используемый для иммунизации животных, содержит
не одну, а несколько антигенных детерминант, в организме
вырабатываются множество антител. Такие антитела
называются поликлональными. Их состав непостоянен и зависит
от вида животного, его генетических особенностей и
207
физиологического состояния. Для очистки и стандартизации
поликлональных антител используют аффинную
хроматографию (жидкостная хроматография), в которой
разделение смеси биологически активных веществ происходит
за счет различия в их биоспецифическом взаимодействии с
комплементарными сорбционными центрами неподвижной
фазы. Для этого сыворотку крови от иммунизированного
животного пропускают через колонку с полисахаридными
шариками, к которым ковалентно пришит антиген.
Специфические антитела связываются с антигеном и остаются в
колонке. Все другие белки, а также антитела с низким сродством
с антигеном проходят через колонку. Поскольку связь антигена
с антителом нековалентна, оставшиеся в колонке специфические
антитела затем смываются кислым или щелочным раствором.
Но даже такая очистка антител не позволяет полностью
избавиться от гетерогенности препарата.
Антитела с одной специфичностью, реагирующие с
единственной антигенной детерминантой (моноклональные)
получают методом клеточной инженерии. Препараты
моноклональных антител характеризуются постоянством
состава и физикохимических свойств, низкой вероятностью
перекрестной реакции с "чужими" антигенами, то есть
негетерогенны.
Взаимодействие антиген – антитело можно представить
схемой, соответствующей специфическому связыванию с
образованием комплекса АТ – АГ
аАг + bАт
∗
→→→→ а(АгАт
∗
) + (b-а)Ат∗ (схема 1)
или
∗
аАг
+ bАт + сАг →→→→ d(Аг∗Ат) + e(АгАт) + (a-d)Аг
∗
+(с-e)Аг
(схема 2)
В первом варианте в анализируемом образце образуется
комплекс АгАт
антитела Ат
∗
∗
из антигена Аг и меченого ферментом
, добавленного в избытке по отношению к Аг.
208
Содержание определяемых веществ можно установить,
регистрируя количество комплекса АгАт
∗
или оставшегося в
свободном состоянии Ат∗. Этот вариант ИФА называют
неконкурентным.
Во втором варианте (схема 2) лимитирующим субстратом
является антитело Ат. Меченый антиген Аг∗ добавляют в
анализируемый образец в определенном количестве. Образуя
комплекс с антителом Аг
∗
Ат, меченый антиген Аг
∗
будет
конкурировать с немеченым антигеном Аг, концентрацию
которого нужно определять. Из уравнения видно, что
концентрация комплекса Аг
∗
Ат обратно пропорциональна
концентрации Аг. По известной заранее концентрации Аг
можно определить содержание Аг. Этот вариант называется
конкурентным ИФА.
При выборе ферментов в качестве меток в ИФА
руководствуются рядом требований. Фермент должен длительно
сохранять свою активность, не теряя ее при образовании
комплекса антитела с антигеном. Кроме того, фермент должен
обладать высокой специфичностью к субстрату. В качестве
меток чаще используют пероксидазу хрена, щелочную
фосфатазу и β-галактозидазу Escherichia coli. Для этих целей
перспективны люциферазы светлячков и светящихся бактерий.
Активность ферментов детектируют спектрофотометрически,
флуориметрически или электрохимически. Люциферазные
реакции сопровождаются биолюминесценцией, которая и
используется для ИФА
люцифераза светлячков
АТФ+люциферин+О
→→→→АМФ+Фн + оксилюциферин + h
2
ν
560 нм
,
где АТФ – аденозинтрифосфат, АМФ – аденозинмонофосфат,
Ф
– ортофосфат.
н
В пероксидазной реакции, протекающей по схеме:
∗
209
АН2 + Н2О2 ⇒ А + 2Н2О,
в качестве АН2 могут быть использованы различные
соединения. Восстановленный бесцветный о-фенилендиамин,
например, в пероксидазной реакции превращается в окисленную
окрашенную в красный цвет форму с максимумом поглощения
при 435 нм, которую можно регист-рировать
спектрофотометрически.
Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз фосфорных
эфиров. Например, 4-нитрофенилфосфат превращается в 4нитрофенил, который можно регистрировать при длине волны
405 нм. 4-метилумбеллиферилфосфат превращается в 4метилумбеллиферон, флуоресцирующий при 450 нм после
возбуждения при длине волны 365 нм.
β-Галактозидаза катализирует гидролиз лактозы с
образованием глюкозы и галактозы. Если вместо природного
субстрата взять 4-метилумбеллиферил-β-
D-галактозид, при
гидролизе образуются галактоза и 4-метилумбеллиферон,
который можно определять по спектрам флуоресценции.
В иммуноферментном анализе часто используют антигены,
меченые дегидрогеназами. Образующийся в результате реакции
NADH+ контролируют спектрофото-метрическим и
электрохимическим методами. В гомогенном
электрохимическом иммуноанализе используют антигены,
меченые электрохимически активными частицами. Так,
наркотическое вещество морфин можно пометить ферроценом.
Определение морфина в этом случае проводят
амперометрически по току окисления ферроцен-морфинового
комплекса в присутствии и в отсутствии антител к морфину.
Для маркирования антител или антигенов ферментами
используют биохимические, иммунологические и генноинженерные методы.
В биохимических методах используется сшивка фермента
E
c антителом или антигеном с участием свободных
210
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]