Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы исследования качества продуктов питания. Учебное пособие
.pdf
детектирование, ИАД) (рис. 3.17). Он заключается в
ступенчатом наложении на рабочий электрод потенциала,
последовательно приводящего к окислительной и
восстановительной деструкции адсорбированных на электроде
веществ. Эта операция выполняется после каждой очередной
инжекции и даже в процессе элюирования компонентов смеси.
Критерием, определяющим необходимость выполнения такой
операции и готовность системы к очередной инжекции, для
рабочей станции хроматографа служит величина остаточного
тока в цепи. При анализе природных матриц сложного состава
очистка электродов и ячейки проводится промывкой кислотами
и специальными моющими смесями.
Конструкция проточных ячеек имеет очень важное
значение для ЭХ детектирования в ВЭЖХ. В большинстве их
можно отнести к одному из трех принципиально различающихся
по устройству вариантов: "тонкопленочные", "стенка - сопло" и
"поток сквозь пористый электрод". Последняя конструкция
имеет существенные отличия от двух предыдущих. Это
обусловлено тем, что при кулонометрическом детектировании
требуется близкая к 100% эффективность (выход)
электрохимической реакции по току, и развитая поверхность
рабочего электрода способствует этому. В свою очередь, при
амперометрическом детектировании степень
электрохимической конверсии определяемого вещества не
превышает 10% и более высокие аналитические характеристики
детектора обеспечиваются тонкопленочными ячейками или
ячейкой "стенка-сопло". Амперометрические детекторы имеют
значительно более низкие пределы обнаружения по сравнению с
кулонометрическими.
81
Рис. 3.17. Конструкция амперометрического детектора
Конструкция кондуктометрического детектора,
используемого для определения аминокислот и других
электрохимически активных веществ, представлена на рис.3.18.
Определения основаны на измерении сопротивления
анализируемого раствора.
Масс-спектральный (МС) детектор
Идентификация компонентов сложных образцов при
выполнении анализов пищевых продуктов с помощью ВЭЖХ
представляет собой серьезную задачу. Как правило, разделенные
вещества могут быть опознаны с помощью детектора с диодной
матрицей. Но этот спектральный метод недостаточно
специфичен, если различия в спектрах малы. Можно
82
воспользоваться более специфичными методами обнаружения,
например, обнаружением по способности к флуоресценции. При
необходимости опознания многих веществ в смеси такой подход
также может не дать желаемого результата. В то же время с
помощью МС детектирования можно с высокой степенью
достоверности идентифицировать различные вещества в
разнообразных матрицах.
Рис. 3.18. Простейшая схема кондуктометрического
детектора
Устройства сопряжения МС детектора с ВЭЖХ
значительно сложнее, чем в ГЖХ. Это связано с тем, что при
испарении растворителя, используемого для жидкостной
хроматографии (при переводе его в газовую фазу), наблюдается
1000-кратное увеличение объема. В то же время массспектральный анализ требует высокой степени разрежения в
системе. Только появление двух новых способов ионизации
(ионизации с помощью электростатического ("электроспрей")
распыления и химической ионизации при атмосферном
давлении), вытеснившие ионизацию с помощью горячего
83
распыления и ионизацию пучком электронов, позволили создать
эффективные системы МС-ВЭЖХ. Новые способы ионизации
позволяют анализировать вещества с широким диапазоном
молекулярных масс (до 150000 дальтон) и полярностью. Они
характеризуются высокой чувствительностью высокой
чувствительностью. Выбор способа сопряжения жидкостного
хроматографа с масс-спектрометром, подходящего для решения
прикладных задач, зависит от таких факторов, как полярность,
молекулярная масса анализируемых веществ, устойчивость к
высоким температурам.
На рис.3.19 показана схема устройства сопряжения,
обеспечивающего ионизацию определяемых веществ при
атмосферном давлении. Выходящая из колонки подвижная фаза,
содержащая анализируемые вещества, в системе
электростатического распыления попадает через иглу
распылителя 1 в виде капель в электростатическое поле,
характеризующееся высокой напряженностью. Мелкие капельки
аэрозоля в этом поле приобретают заряд. В распылителе
происходит испарение растворителя ("уменьшение размеров
капель"), ионизация и десорбция ионов анализируемых веществ.
Под действие электромагнитного поля эти ионы переносятся в
анализатор масс через серию каскадов вакуумной системы и
узлов, фокусирующих пучок ионов.
При ионизации с помощью электростатического распыления
могут образовываться многозарядные ионы
высокомолекулярных анализируемых веществ, таких, как белки
и пептиды. Поскольку разделение в анализаторе масс
обеспечивается по отношению массы к заряду (M
/z), можно
пользоваться относительно дешевыми масс-спектрометрами с
верхней границей диапазона до нескольких тысяч M/z. При этом
удается анализировать вещества молекулярными массами
свыше 150 000 дальтон. Системы с ионизацией при помощи
электростатического распыления были в основном
84
предназначены для анализа высокомолекулярных соединений.
Однако такой способ ионизации успешно используется и для
анализа низкомолекулярных полярных веществ.
Рис.3.19. Принцип работы интерфейса для ионизации при
атмосферном давлении. 1-поток распыляющего газа, 2испарение растворителя и образование аэрозоля, 3диэлектрический капилляр, 4-нагретый осушающий газ (азот),
5- ионы, 6-испарение, 7-достижение критического радиуса, 8кулоновский взрыв, 9-испарение, 10, 11, 12-анализируемые ионы,
их фрагментация
Химической ионизацией при атмосферном давлении
можно пользоваться для анализа умеренно полярных веществ.
Для химической ионизации при атмосферном давлении
необходима некоторая летучесть веществ.
Практическое использование масс-селективного детектора
можно проиллюстрировать примером. По масс-спектрам
+
триацилглицерида (иону [М
+
М
), например, можно определить как степень ненасыщенности,
NH4]+, соответствующему массе
так и длину жирнокислотной цепи. При этом нет необходимости
85
проводить гидролитическое расщепление триацилглицерида.
Сочетание МСД с ВЭЖХ позволяют определять
жирнокислотный состав веществ, соответствующих
определенным хроматографическим пикам. При полном
сканировании легко идентифицируются вещества, концентрация
которых достигает десятков нг. Если необходим более точный
количественный анализ, используется режим регистрации
индивидуальных ионов. Достигаемые при этом пределы
обнаружения составляют десятки пкг.
Рефрактометрический детектор
Рефрактометрическим детектором регистрируется разница
показателя преломления раствора, находящегося в кювете для
образца, и чистой подвижной фазы, находящейся в кювете
сравнения.
Это детектор универсального (неселективного) типа.
Принцип действия – измерение изменения показателя
преломления растворителя при нахождении в нем молекул
пробы (рис.3.21).
Рис.3.21. Оптическая схеме рефрактометрического детектора
Кювета состоит из двух призм. Через одну кювету
протекает растворитель, через другую растворитель с пробой.
86
Если через обе кюветы течет растворитель, то растры
совмещаются, освещение фотоприемника не меняется. Если
вместе с растворителем через кювету протекает компонент
анализируемой пробы, то фотоприемник регистрирует сигнал,
пропорциональный концентрации определяемого вещества.
Поскольку состав подвижной фазы должен оставаться
неизменным во время анализа, этот детектор не пригоден для
использования при градиентных разделениях. В
рефрактометрических детекторах используют преломление
света по закону Снеллиуса, закону Френеля;
интерференционный или эффект Христиансена. Наиболее
популярен первый из этих типов детекторов, который основан
на использовании двух кювет. Чувствительность
рефрактометрического детектора невысока и для него
характерен сильный дрейф базовой линии при изменении
температуры. Поэтому таким детектором пользуются в
основном при анализе углеводов и кислот.
♦
♦
♦
Сравнительные характеристики различных вариантов
детектирования, используемых в ВЭЖХ, приведены в таблице
3.6.
Среди детекторов, используемых в ВЭЖХ при анализе
пищевых продуктов, существует своеобразное "разделение
труда". Спектрофотометрический детектор чаще используют
при определениях органических кислот; производных жирных
кислот; неорганических анионов. ДМ детектор более популярен
при определениях антиоксидантов, консервантов,
ароматических добавок, красителей, остатков лекарственных
средств, микотоксинов, пестицидов, витаминов, производных
биогенных аминов. ФЛ детектор используют при определениях
87
искуственных послащивающих средств, микотоксинов,
витаминов, карбаматных пестицидов, глифосата, аминокислот.
Масс-спектральный детектор используют для определения
пестицидов, белков, пептидов.
Таблица 3.6. Сравнительные характеристики различных методов
детектирования в ВЭЖХ органических веществ
Метод
детектирования
Спектрофотометр
ический детектор
Диодноматричный
детектор
Флуоресцентный 10-7 - 10
Предел
обнаружения,
моль/л
10-5 - 10-7 низкая Низкая стоимость,
10-5 - 10-8 высокая Возможность получения
Селективность
-10
высокая
Преимущества детектора
универсальность
спектральной информации, в
том числе о чистоте пика
Массселективный
Электрохимическ
ий
Рефрактомет
рический
Непрямое
спектрофотометр
ическое,
флуоресцентное
или
амперометрическ
ое детектирование
-10
10
-10
10
- 10
11
-5
10
10- 100
раз
меньшая
Очень
высокая
-
высокая Селективен для
Низкая
универсальность
Возможность получения
структурной информации
электроактивных веществ
Универсальность, невозможно
градиентное элюирование
88
4.СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Спектроскопическими методами анализа называются
методы, основанные на взаимодействии вещества с
электромагнитным излучением.
Электромагнитное излучение представляет собой вид
энергии, которая распространяется в вакууме со скоростью
около 300000 км/с и которая может выступать в форме света,
теплового и ультрафиолетового излучения, микро- и радиоволн,
гамма- и рентгеновских лучей.
Электромагнитное излучение обладает двойственной
природой: волновой и корпускулярной. С волновой точки
зрения характеристиками электромагнитного излучения
являются длина волны λ, частота ν, амплитуда и скорость
распространения. С корпускулярной точки зрения
электромагнитное излучение представляет поток отдельных
частиц – фотонов. Энергия каждой такой частицы (Е) находится
в строгом соответствии с частотой излучения согласно
уравнению, выведенному Эйнштейном:
или Е = h·с/ λ, (4.1)
Дж·с - постоянная Планка, с – скорость
где h = 6,626·10
Е = h· ν
-34
света, 3·108 м/с.
Представление о корпускулярной природе электромагнитного излучения необходимо для описания процессов
поглощения и испускания света. В ходе поглощения излучения,
лежащего в определенной области спектра, отдельный атом,
ион или молекула, взаимодействуя с фотоном, увеличивает свою
энергию на величину, равную энергии фотона, и переходит из
основного энергетического состояния в возбужденное.
Возможные энергетические состояния частицы дискретны и
определяются природой частицы, ее окружением и физическим
состоянием вещества. Процессы поглощения вещества
отдельными атомами и молекулами протекают по-разному, и
89
соответственно этому спектроскопия подразделяется на
атомную и молекулярную.
Испускание излучения наблюдается тогда, когда частица,
находящаяся в возбужденном состоянии, переходит в состояние
с меньшей энергией. При этом избыток энергии высвобождается
в виде фотона. Для перевода частицы в возбужденное состояние
можно использовать поглощение излучения от внешнего
источника, высокую температуру (в пламени или плазме),
бомбардировку электронами или ионами и другие методы.
Частота (длина волны) излучения или поглощения
определяется составом вещества, а интенсивность
пропорциональна количеству излучающих или поглощающих
частиц, т. е. количеству (концентрации) определяемого вещества
в пробе.
Спектральные методы предоставляют широкие
возможности для получения аналитических сигналов в
различных областях спектра электромагнитного излучения. Это
γ-лучи, рентгеновское излучение, ультрафиолетовое (УФ),
видимое и инфракрасное (ИК) излучение, а также
микроволновая и радиоволновая области спектра. Энергия
квантов перечисленных видов излучения охватывает очень
широкий диапазон, от 108 до 10-6 эВ, соответствующий
диапазону частот от 1020 до 106 Гц.
Природа взаимодействия столь различающихся по энергии
квантов с веществом принципиально разная. Так, излучение γ квантов связано с ядерными процессами. Излучение квантов в
рентгеновском диапазоне обусловлено электронными
переходами во внутренних электронных слоях атома.
Испускание квантов УФ и видимого излучения или
взаимодействие вещества с ними есть следствие перехода
внешних, валентных электронов. Поглощение ИК и
микроволновых квантов излучения связано с переходом между
колебательными и вращательными уровнями молекул.
90
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]