Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Методы исследования качества продуктов питания. Учебное пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 / 2914 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 > Следующая >>>

антипараллельно, неспаренные электроны отсутствуют. В триплетных состояниях спины электронов ориентированы параллельно (рис. 4.12). Поэтому в синглетном состоянии молекула диамагнитна, а в триплетном – парамагнитна.

↓ ↑

↑↓ ↑ ↑

синглетное синглетное триплетное

основное возбужденное возбужденное

состояние состояние состояние

Рис.4.12. Ориентация электронных спинов в синглетном и триплетном состояниях

Каждое энергетическое состояние валентных электронов дополнительно характеризуется набором уровней колебательной энергии. Взаимное расположение электронных и колебательных уровней можно представить графически в виде диаграммы Яблонского, наглядно поясняющей различные абсорбционные и эмиссионные переходы в молекуле (рис.4.13).

Флуоресценция - это испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона с низшего возбужденного синглетного состояния в основное (S1 → S0). В синглетном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов (спины этих электронов спарены). Такие переходы квантовомеханически "разрешены", а типичные величины скоростей испускания для них 108 с-1. Времена затухания (средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии) флуоресценции составляют около 10 нс.

131

Рис. 4.13. Диаграмма Яблонского: hνА – поглощение света; hνF

– флуоресценция; hνР – фосфоресценция; 0,1,2 и т.д. – колебательные подуровни

Фосфоресценция - это испускание, происходящее при

переходе между состояниями различной мультиплетности, как правило, из возбужденного триплетного состояния в синглетное

основное. В триплетном состоянии эти электроны не спарены,

т.к. их спины имеют одинаковую ориентацию. При переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние необходимо изменение ориентации спина. Такие переходы не разрешены, константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции - от миллисекунд до секунд.

Интенсивной флуоресценцией обладают конднсированные ароматические системы, такие как молекулы антрацена,

132

флуоресцеина или флуорена. В веществах, проявляющих значительную флуоресценцию, электроны в основном делокализованы.

Одним из широко распространенных флуорофоров является хинин, который добавляют в тонизирующие напитки. Его присутствие в тонике можно увидеть по слабому голубому свечению, если поставить стакан с ним на солнечный свет. Хинин, возбуждаемый ультрафиолетовым излучением солнца, при возвращении в основное состояние испускает голубой свет с длиной волны около 450 нм. Многоядерные ароматические углеводороды, такие, как антрацен или перилен, также флуоресцируют, чем частично определяется голубая флуоресценция бензина.

Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции - это зависимость интенсивности флуоресцен-

ции от длин волн (нм) или волновых чисел (см-

). На рис. 4.14

представлены спектры возбуждения и флуоресценции флуоресцеина.

Рис. 4.14. Спектры поглощения (возбуждения) А и флуоресценции (эмиссии) В для флуоресцентного индикатора флуоресцеина

133

За поглощением света обычно следует несколько других

процессов. Возбуждение флуорофора как правило, происходит до некоторого высшего колебательного уровня состояний (S либо S

). За некоторыми редкими исключениями, для молекул в

конденсированной фазе характерна быстрая релаксация на самый нижний колебательный уровень состояния S цесс называется внутренней конверсией и происходит за 10

. Этот про-

-12

с.

Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки

-8

к 10

с, внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается

до процесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденного состояния. Аналогично поглощению обратный переход электронов на самый нижний электронный уровень также приводит к колебательно возбужденному состоянию. Термическое равновесие

-12

достигается за время порядка 10

с. Следствием этого является

то, что спектр поглощения молекулы отражает колебательную структуру возбужденных электронных состояний, а спектр испускания - колебательную структуру основного электронного состояния. В большинстве случаев электронное возбуждение не сильно изменяет расположение колебательных уровней энергии. В результате этого колебательные структуры, проявляющиеся в спектрах поглощения и испускания, сходны.

Молекулы в состоянии S

конверсии в первое триплетное состояние Т

могут также подвергаться

. Испускание из Т

1 ,

называемое фосфоресценцией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из S

в Т1 называется

интеркомбинационной конверсией. Переход из Т1 в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции. На испускание флуоресценции могут влиять различные факторы: влияние

134

растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях.

Для явления флуоресценции известно несколько

основных характеристик.

Стоксов сдвиг. Как правило, всегда наблюдается сдвиг

испускания относительно поглощения в сторону больших длин волн, т. е. потеря энергии (исключение составляют атомы в газовой фазе). Это явление впервые наблюдал Стокс в 1852 г. Потери энергии между возбуждением и испусканием неизменно наблюдаются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень состояния S возбужденные колебательные уровни состояния S

. К тому же обычно происходит переход на

(рис.4.13),

что приводит к дополнительной потере колебательной энергии. Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях. В газовой фазе у атомов и молекул не всегда имеется стоксов сдвиг. Испускание без сдвига наблюдают тогда, когда концентрации газа достаточно малы для того, чтобы возбужденные молекулы не претерпевали столкновений с другими молекулами до процесса испускания. Такие столкновения приводят к релаксации. В жидкой фазе процессы соударения происходят непрерывно.

Независимость спектра испускания от длины волны

возбуждения. Спектр испускания флуоресценции обычно не

зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния S

-12

происходит за время порядка 10

с и является результатом

. Эта релаксации

сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина

135

волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания. Существуют исключения, когда испускание может происходить как из S2, так и из S

-состояния. Кроме того, возбуждение на

красном крае спектра поглощения часто ведет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обусловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно возможно для тех флуорофоров, которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем.

Правило зеркальной симметрии. Обычно спектр

испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу из S0 в S

. Симметричная

природа этих спектров определяется тем, что как поглощение, так и испускание обусловлены одними и теми же переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний S

и S

распределение электронов в состоянии S0 а и S

. Для многих молекул различное

не влияет

существенно на эти уровни энергии. Согласно принципу Франка

- Кондона, все электронные переходы происходят без изменения

межъядерного расстояния. В результате, если вероятность перехода (фактор Франка - Кондона) между нулевым и вторым колебательными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход будет наиболее вероятен также и в испускании.

Необходимым условием для зеркальной симметрии является представление спектров поглощения и испускания в соответствующих единицах. Наилучшая симметрия должна существовать между модифицированными спектрами. Соответствие между такими спектрами наблюдается для полиядерных ароматических углеводородов. Несмотря на то, что правило зеркальной симметрии часто выполняется, из него существует множество исключений.

136

Во флуоресцентном методе количественный анализ

основан на зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации вещества. Однако эта зависимость сложнее, чем в абсорбционном анализе (закон Бугера-Ламберта-Бера). Она

зависит от квантового выхода флуоресценции Q. Квантовый

выход флуоресценции - это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных

число испущенных фотонов

Q = −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− (4.11)

число поглощенных фотонов

Энергетический выход флуоресценции всегда меньше

единицы из-за стоксовых потерь.

Для очень разбавленных растворов зависимость между

интенсивностью флуоресценции I и концентрацией с

приближенно выражается как

= Q I0εlc, (4.12)

где I0 – интенсивность внешнего источника света, а ε, l, c имеют те же значения, что и в формуле выражения закона Бугера-Ламберьа-Бера. Однако, в отличие от оптической плотности, интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна интенсивности источника света. Аналитический сигнал тем больше, чем выше интенсивность источника. Уравнение (4.12) является математическим основанием количественного флуоресцентного анализа: прямой пропорциональности интенсивности излечении концентрации определяемого соединения:

I = kc (4.13)

Линейная зависимость интенсивности излучения от концентрации сохраняется в пределах трех порядков величин концентрации (от 10-7 до 10-4 моль/л). С ростом концентрации

-4

выше 10

моль/л градуировочный график заметно отклоняется

вниз. Это обусловлено эффектами концентрационного тушения и самопоглощением. Тушение флуоресценции происходит за счет интеркомбинационной конверсии, обусловленной

137

столкновением возбужденной молекулы с другими молекулами – особенно парамагнитными (растворенный кислород).

Самопоглощение состоит в поглощении части испускаемого света слоем флуоресцирующего вещества.

Молекулы многих соединений не проявляют флуорофорных свойств или они плохо выражены. В таких случаях используют прием искусственного придания флуоресцентных свойств исследуемому веществу за счет ковалентного (посредством химической реакции) или нековалентного (без химической реакции) связывания со специальными веществами, обладающими флуоресцентными свойствами (флуоресцентных зонды, маркеры). Например, нафтиламиносульфоновые кислоты используют в качестве ковалентно связанных зондов для белков и мембран. Эти зонды почти не флуоресцируют в воде, но интенсивно флуоресцируют при растворении в неполярных растворителях или при связывании с макромолекулами.

Во флуоресцентной спектроскопии измеряются как спектры возбуждения, так и спектры испускания. Спектры изображается как в шкале длин волн, так в шкале волновых чисел. Большинство приборов градуированы в шкале длин волн, их легче интерпретировать визуально. Записанный спектр испускания должен соответствовать потоку фотонов, испущенных на каждой длине волны, приходящемуся на интервал длин волн и определяемому шириной щели и дисперсией монохроматора испускания. Аналогично, спектр возбуждения должен представлять собой зависимость относительного квантового выхода для каждoй длины волны возбуждения. На рис. 4.15 представлена блок-схема спектрофлуориметра.

138

Монохроматор

(эмиссия)

линза

Ксеноновая

импульсная

лампа

Монохроматор

(возбуждение)

зеркало

фотоумножитель

фотодиод

кювета

Рис.4. 15. Блок-схема спектрофлуориметра

На пути возбуждающего и испускаемого световых потоков ставят поляризаторы. Чаще всего поляризаторы находятся вне светового потока, их вводят для измерений анизотропии флуоресценции или для выделения поляризованной компоненты испускаемого и/или возбуждающего света.

Спектры флуоресценции могут искажаться по

следующим причинам:

• интенсивность света от возбуждающего источника

является функцией длины волны. Даже если возбуждающий свет пропускают через систему расщепления пучка и его интенсивность корректируют путем деления, отношение сигналов может зависеть от длины волны;

• эффективность монохроматора является функцией

длины волны;

139

• Оптическая плотность образца может выходить за

пределы линейной области.

Для получения «исправленных» спектров испускания прибор должен иметь следующие характеристики:

• Источник света должен иметь постоянный выход

фотонов на всех длинах волн;

• Монохроматор должен пропускать фотоны всех длин

волн с равной эффективностью;

• Эффективность (спектральная ширина) монохроматора

не должна зависеть от поляризации;

• Приемник (фотоумножитель) должен регистрировать

фотоны всех длин волн с одинаковой эффективностью.

В качестве источника света чаще используют ксеноновые лампы. Они обеспечивают почти непрерывный спектральный выход в области 270 - 700 нм, за исключением нескольких узких линий вблизи 450 нм. Испускание света ксеноновыми дуговыми лампами происходит за счет рекомбинации электронов с ионизованными атомами Хе. Эти ионы образуются при столкновениях атомов Хе с электронами в дуге. Непрерывный спектр испускания возникает при полном удалении электронов из атомов. Атомы Хе, находящиеся в возбужденном состоянии, дают линии в спектре, а не широкие полосы; этим обусловлены пики вблизи 450 нм. Интенсивность испускания резко падает в области 280 нм. Зависимость излучения ксеноновой лампы от длины волны является основной причиной искажений спектров возбуждения соединений, поглощающих в ультрафиолетовой области.

Монохроматизация светового потока в спектрофлуориметрах осуществляется с помощью призм, голографических дифракционных решеток. Монохроматор состоит из входной и выходной щелей, а также диспергирующего устройства.

140

<<< < Предыдущая 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 / 2914 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]