Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнологические процессы и биореакторы разработка и проектирование. Учебное пособие.pdf
191
Способ Лайнуивера–Берка заключается в построении графика урав-
нения Михаэлиса–Ментен в координатах
:
.
При этом отрезок , отсекаемый прямой на оси ординат, равен
:
. Тангенс угла наклона
прямой равен отношению
:
. Используя соотношение
, находим
.
Способ Эдди–Хофсти заключается в построении линейного графика
в координатах
на основании соотношения
.
Отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат,
. Тангенс угла наклона прямой равен
:
.
.
Пример 4.17. Для ферментативной реакции с участием ингибитора
предложен механизм
, ,
в соответствии с которым описывается процесс конкурентного ингибирования. В этом случае субстрат и ингибитор конкурируют между собой
за право вступить в реакцию с ферментом; ингибирование характеризуется
константой
. Записать кинетическое уравнение для процесса
192
в начальный момент времени, используя принцип квазистационарных кон-
центраций, с учетом условий:
и
; проанализировать
кинетическое уравнение в координатах уравнения Лайнуивера–Берка.
Можно записать следующие три уравнения:
для скорости образования продукта
;
материального баланса по ферменту
;
для скорости образования промежуточного продукта
.
Далее можно выразить
через
и подставить в уравнение ма-
териального баланса, которое примет вид
; затем,
используя уравнение
, можно выразить
следующим образом:
. Полученное
выражение для
подставляем в уравнение
,
которое решаем относительно концентрации
:
.
Знание или возможность вычисления
позволяет получить искомое кинетическое уравнение в начальный период времени протекания
реакции:
193
,
где
и
.
Запишем полученное уравнение
в координатах
уравнения Лайнуивера–Берка:
.
Зависимость
от
представляет прямую линию, причем отре-
зок, отсекаемый прямой на оси ординат, равен
, а тангенс угла
наклона прямой равен
, т.е. он больше, чем при отсутствии
ингибирования.
Пример 4.18. При бесконкурентном ингибировании механизм реак-
ции имеет вид
,
В этом случае образуется один неактивный комплекс за счет
присоединения ингибитора к промежуточному соединению с константой
равновесия обратимой реакции:
. Требуется вывести
уравнение для начальной скорости реакции, ускоряемой ферментом в при-
сутствии ингибитора, учитывая следующие условия между начальными
концентрациями субстрата, ингибитора и фермента:
;
; каким образом можно определить параметры этого кинетиче-
ского уравнения?
194
Скорость реакции равна скорости образования продукта :
.
В присутствии ингибитора уравнение материального баланса для
фермента примет вид
. Выражая концентрацию
как
и подставляя в уравнение материального баланса,
получим
.
Для нахождения концентрации
используем принцип квазиста-
ционарных концентраций
.
Записанное соотношение с учетом выражения
упрощается до вида
.
Выразив текущую концентрацию фермента из последней формулы
, подставляем полученное выражение в уравнение материаль-
ного баланса
, которое решаем относительно
концентрации
:
.
Знание концентрации
позволяет получить путем подстановки
в уравнение
искомое выражение для начальной скоро-
сти ферментативной реакции с учетом заданных условий при бесконкурентном ингибировании:
195
,
где
;
.
Из записанных выше соотношений видно, что параметры
и
уравнения Михаэлиса–Ментен уменьшаются в случае ферментативной
реакции при бесконкурентном ингибировании в
раз.
Параметры полученного кинетического уравнения для ферментатив-
ной реакции при бесконкурентном ингибировании можно определять
графическим способом в координатах Лайнуивера–Берка:
.
Строя график в координатах
, по отрезку , отсекаемому
прямой на оси ординат, определяют величину
; по тангенсу
угла наклона прямой – величину
. Эффективную
константу
можно также определить по отрезку, отсекаемому прямой
на оси абсцисс:
.
Пример 4.19. При смешанном ингибировании механизм реакции
имеет следующий вид:
,
,
.
Отличительной чертой этого типа ингибирования является неравен-
ство констант диссоциации комплексов и , т.е.
:
196
;
.
Требуется вывести уравнение для начальной скорости ферментатив-
ной реакции при смешанном ингибировании, учитывая следующие условия:
;
; каким образом можно определить параметры
этого кинетического уравнения?
Выразим скорость реакции через скорость образования продукта
:
.
В присутствии ингибитора уравнение материального баланса для
фермента запишется в виде:
. Выражая
из формулы
и
из формулы
, получим урав-
нение материального баланса в следующем виде:
.
Используя принцип стационарных концентраций для обратимой ре-
акции, определим концентрацию фермента
:
, где
.
После подстановки
в уравнение материального баланса
и несложных преобразований получаем
выражение для стационарной концентрации
промежуточного соеди-
нения:
.
197
Знание
позволяет получить путем подстановки в уравнение
выражение для начальной скорости ферментативной
реакции при смешанном ингибировании (с учетом начальных условий):
,
где
;
.
Как видно из приведенных формул, эффективная скорость всегда
меньше предельной при
:
. Соотношение констант
и зависит от соотношения и : если , то
;
если , то
.
Параметры полученного кинетического уравнения могут быть опре-
делены графически по способу Лайнуивера–Берка.
Пример 4.20. Гидролиз фумарат-иона с образованием L-малат-иона
ускоряется фумаразой
–
–
.
Предложен следующий механизм ферментативной реакции:
,
где – фермент; – субстрат; – фермент-субстратный комплекс;
– продукт реакции. Требуется записать кинетическое уравнение реакции,
полагая, что
; проанализировать кинетику в начальный момент вре-
мени для условий
и
.
Запишем кинетическое уравнение реакции для фермент-
субстратного комплекса и продукта реакции :
198
;
,
где
.
Из первого и третьего уравнений выразим концентрации
и
:
;
.
Подставляя выражения для
и
в кинетическое уравнение,
получим
,
где
;
;
;
.
Поскольку измерение скоростей реакции проводят в начальный мо-
мент времени, т.е.
,
то кинетическое уравнение упроща-
ется, превращаясь в уравнение Михаэлиса–Ментен:
.
Если
, то
, реакция имеет псевдопервый поря-
док по отношению к субстрату; если же
, то
, реакция
имеет псевдонулевой порядок реакции по отношению к субстрату. В обоих
случаях скорость реакции в нулевой момент времени зависит от
,
причем максимальная скорость
имеет первый порядок по отношению
к
.
199
Пример 4.21. Превращение аденозинтрифосфата (АТФ) в аденозин-
дифосфат (АДФ) протекает по реакции
.
Эта реакция может катализироваться кислотой или ферментом –
аденозинтрифосфатазой
. Для этого случая наиболее простая схема
реакции имеет вид
,
где АТФЕ – промежуточный комплекс. Требуется выразить скорость обра-
зования продукта в зависимости от
, начальной концентрации
фермента и – константы Михаэлиса; показать, что константа
пред-
ставляет собой константу диссоциации промежуточного комплекса;
для интервала времени, когда применим принцип стационарных концентраций (фиксируя начальную концентрацию
фермента и выбирая
начальную концентрацию
), получить выражение для скорости
реакции в начальный момент времени и в конце указанного интервала
времени; выразить в зависимости от
и представить в соответ-
ствующей форме уравнение кинетики, позволяющее определять значения
и
, на основании опытных данных.
………..
9,1
28,6
44,5
59,9
66,7
……………..
0,100
0,400
0,800
1,500
2,000
Рассчитать численные значения
и
.
Для предложенной схемы реакции выражение для скорости реакции
имеет вид
.
200
Применим принцип стационарных концентраций к :
.
Выражая
из уравнения материального баланса
через
, можно записать
,
откуда
.
Подставляя полученное выражение для
в уравнение кинети-
ки, находим
,
где
.
Применяя принцип квазистационарных концентраций к АТФЕ, пола-
гают, что его концентрация постоянна во времени, следовательно, это
соединение находится в равновесии с его продуктами разложения
на исходные вещества:
или
.
Таким образом,
оказывается константой диссоциации промежу-
точного комплекса.
Если
, то, используя уравнение для скорости
W =
реакции, находим
.
Наиболее удобной формой обработки кинетических опытных данных
по уравнению Михаэлиса–Ментен является способ Лайнуивера–Берка: