Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнологические процессы и биореакторы разработка и проектирование. Учебное пособие.pdf
181
1) для , , следовательно,
;
2) обычно
, поэтому с учетом условия 1)
;
3) концентрация промежуточного соединения стационарна,
поэтому принимают, что
.
Подставляя значение
из
в уравнение
, получаем выражение
,
которое после деления числителя и знаменателя на
принимает вид
,
где
.
Величину
принято называть по решению ИЮПАК константой
Михаэлиса.
Подставляя выражение
в уравнение
,
получаем уравнение для скорости образования продукта в начальный
момент времени
.
Если
, тогда
, т.е. начальная скорость
линейно зависит от концентрации субстрата, что подтверждает наблюдаемый на опыте первый порядок реакции по субстрату.
Если
, тогда из уравнения
получаем
,
т.е. начальная скорость не зависит (как и в опыте) от концентрации
субстрата, следовательно, порядок реакции по субстрату будет нулевой,
182
по ферменту – первый, а сама скорость достигает предельного значения,
:
.
При достижении значения
концентрация фермент-
субстратного комплекса
; это означает, что весь фермент
переходит в состав промежуточного соединения, т.е. фермент насыщен
субстратом. В этих условиях удобно сравнивать скорости различных реак-
ций, поэтому запишем уравнение для начальной скорости в следующем
виде:
,
где и
параметры ставшего классическим уравнения Михаэлиса–
Ментен.
Физический смысл константы Михаэлиса
можно пояснить исходя
из уравнения
: она численно равна концентрации субстрата
, при которой активность фермента составляет половину макси-
мальной, т.е.
;
и
имеют одинаковую размерность
концентрации
и лежат в пределах , легко воспроизво-
дятся и не зависят от концентрации фермента. В то же время
является
функцией температуры, pH среды, зависит от присутствия других веществ,
играющих роль ингибитора или активатора.
Если , то
,
где
– субстратная константа, т.е. константа диссоциации фермент-
субстратного комплекса на фермент и субстрат, характеризующая меру
связывания фермента с субстратом. В этом случае константу Михаэлиса
183
можно рассматривать как величину, характеризующую сродство фер-
мента к субстрату; в общем случае
.
При анализе простых ферментных реакций полезно использовать
соотношение , которое, если выполняется условие
,
равно константе скорости
прямой реакции первой стадии механизма
Михаэлиса–Ментен.
Способы определения кинетических параметров уравнения
Михаэлиса–Ментен. Для определения параметров и
используют
несколько способов линеаризации уравнения Михаэлиса–Ментен, которые
позволяют представить экспериментальные данные в удобной для анализа
линейной графической форме.
Первая форма способа Лайнуивера–Берка. Запишем уравнение
Михаэлиса–Ментен в координатах
:
,
которое можно использовать для построения линейного графика (рис. 4.7).
Рис. 4.7. К определению параметров и
по способу Лайнуивера–Берка
tgα = KМ/P
max
184
Отрезок , отсекаемый прямой на оси ординат, будет равен
,
т.е.
; тангенс угла наклона прямой равен
,
т.е.
. Константу
можно также определить
по отрезку, отсекаемому прямой на оси абсцисс, так как при
имеем
и
.
Вторая форма способа Лайнуивера–Берка. При умножении обеих
частей уравнения
на
получим уравнение вида
.
Графическая зависимость
от
представляет собой прямую
линию (рис. 4.8).
Способ Эди–Хофсти. После умножения обеих частей уравнения
на
и несложных преобразований получим
.
Рис. 4.8. К определению параметров и
по второй форме уравнения Лайнуивера–Берка
[S]0/W0
tgα =1/W
max
x
KM/W
max
–KM
185
Построение графика в координатах
, как видно из рис. 4.9,
дает прямую линию, тангенс угла наклона которой
, а отрезок,
отсекаемый на оси ординат, соответствует
. Кроме того, отрезок,
отсекаемый на оси абсцисс, должен быть равен
, так как
при имеем
и
.
Во всех способах обработки экспериментальных результатов, кроме
графических методов, широко используется метод наименьших квадратов.
Ингибирование ферментативных реакций [28]. Вещества, присут-
ствие которых в системе понижает активность фермента, т.е. уменьшает
скорость реакции, называются ингибиторами. Рассмотрим реакцию конкурентного ингибирования, протекающего по следующему механизму:
, (неактивный комплекс).
Константу
называют константой ингибирования или кон-
стантой диссоциации комплекса .
Рис. 4.9. К определению параметров и
по способу Эди–Хофсти
KM/W
max
tgβ = KM
tgα = –KM
W0
W
max
W0/[S]
0
186
При решении задачи будем использовать следующие допущения:
при ,
;
,
поэтому
;
, т.е.
– стационарна;
, т.е.
–
начальная концентрация ингибитора.
Скорость реакции определяется скоростью образования продукта
:
.
В присутствии ингибитора уравнение материального баланса для
фермента примет вид
.
Выражая
как
и подставляя в уравнение материаль-
ного баланса, получим:
.
Согласно принципу равновесных концентраций имеем
,
откуда
.
Из последнего уравнения выразим концентрацию фермента
:
и подставим в формулу
:
.
187
Полученная формула для расчета
позволяет получить выражение для расчета начальной скорости реакции, ускоряемой ферментом
в присутствии ингибитора
,
где
– эффективная константа, зависящая от
и
.
Сравнение уравнений Михаэлиса–Ментен
и
пока-
зывает, что начальная скорость реакции в присутствии ингибитора всегда
меньше скорости реакции в его отсутствие; предельные значения скорости
в обоих случаях для большинства концентраций субстрата одинаковы
и равны
. Если
и
, скорость
реакции
в присутствии ингибитора будет равна
.
Выражение для расчета константы
ингибирования получим
из уравнения
:
.
Таким образом, для определения
необходимо знание начальной
концентрации ингибитора
,
и
. Графическую обработку резуль-
татов опытов в отсутствии ингибитора и в его присутствии удобно прово-
дить способом Лайнуивера–Берка в координатах
.
Для неконкурентного ингибирования в книге [28] рассматривается
простейший механизм процесса:
,
,
где
,
.
188
Если оба комплекса неактивны, т.е. не дают продукта, а константы
их диссоциации равны между собой, т.е.
, то это равносильно
дополнительному условию: ингибитор не мешает взаимодействию
субстрата с ферментом, но уменьшает скорость реакции из-за неактивности образующихся комплексов на поверхности фермента.
Выражение для начальной скорости записывается в следующем
виде:
,
где
.
Из записанного выражения следует, что в этом случае изменяется
предельная скорость процесса, но константа Михаэлиса остается постоянной. Если
и
, то скорость реакции
при неконкурент-
ном ингибировании будет равна
.
Выражение для константы ингибирования, полученное из формулы
,
, показывает, что
можно вычислить
при известной
, измеряя скорости реакции в отсутствие и присутствии
ингибитора. Обработка экспериментальных данных для неконкурентного
ингибирования осуществляется по способу Лайнуивера–Берка в коорди-
натах
:
.
Линеаризованное уравнение позволяет определить ,
,
и
, зная
.
189
Пример 4.16. Методом квазиравновесных концентраций получить
уравнение для начальной скорости ферментативной реакции
,
протекающей по предложенному Михаэлисом–Ментен механизму,
с учетом условия
Каким образом определяются параметры
этого уравнения?
Для простейшей ферментативной реакции Л. Михаэлис
и М. Ментен рассматривали механизм, состоящий из двух стадий (первая
реакция – обратимая и быстрая, вторая реакция – необратимая и
медленная):
.
Скорость этого процесса определяется лимитирующей стадией, т.е.
скоростью образования продукта :
.
Для нахождения концентрации
используем метод квазиравно-
весных концентраций
.
Для исключения текущей концентрации фермента
используем
уравнение материального баланса по ферменту
.
Тогда имеем
.
Уравнение для общей скорости реакции можно записать в следую-
щем виде:
,
190
где
– предельная скорость реакции;
– суб-
стратная константа, получившая название константы Михаэлиса.
Уравнение материального баланса по субстрату записывается
следующим образом:
; однако в начальный момент
времени при с учетом условий
,
,
уравнение
примет вид
,
где
– начальная концентрация субстрата;
– текущая концентрация
субстрата.
Уравнение
для скорости образования продукта с учетом
в начальный период времени запишется в виде уравнения
Михаэлиса–Ментен:
;
для определения параметров и
полученного кинетического урав-
нения используют способы Лайнуивера–Берка и Эди–Хофсти.
Гидролиз N-глутарил-L-фенилаланин-p-нитроанилида в присутствии
фермента -химотрипсина приводит к образованию двух продуктов:
p-нитроанилина и N-глутарил-L-фенилаланина. На основании полученных
опытных данных и полагая, что процесс описывается уравнением
Михаэлиса–Ментен, определить кинетические параметры ,
и
.
Из экспериментов известно:
,
…………………
2,5
5,0
10,0
15,0
…..
3,7
6,3
9,8
11,8