Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов. Учебно-методическое пособие
.pdf
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования
«Казанский национальный исследовательский
технологический университет»
И. А. Дегтярева, А. С. Сироткин
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ
ПОТЕНЦИАЛ ПОЧВЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Учебно-методическое пособие
Казань
Издательство КНИТУ
2019
УДК 631(075)
ББК 40.3я7
Д26
Д26
Дегтярева И. А.
Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов :
учебно-методическое пособие / И. А. Дегтярева, А. С. Сироткин;
Минобрнауки России, Казан. нац. исслед. технол. ун-т. – Казань :
Изд-во КНИТУ, 2019. – 112 с.
ISBN 978-5-7882-2647-7
ISBN 978-5-7882-2647-7
©
Дегтярева И. А., Сироткин А. С., 2019
©
Казанский национальный исследовательский
технологический университет, 2019
УДК 631(075)
ББК 40.3я7
Печатается по решению редакционно-издательского совета
Казанского национального исследовательского технологического университета
Рецензенты:
проф. О. Н. Ильинская
проф. М. Р. Шарипова
Рассмотрены методы изучения перспектив и возможностей почвенного
микронаселения для последующего создания на основе эффективных микроорганизмов биопрепаратов комплексного действия.
Предназначено для студентов, обучающихся по образовательным программам подготовки магистров по направлению 19.04.01 «Биотехнология».
Подготовлено на кафедре промышленной биотехнологии.
2
СОДЕРЖАНИЕ
Сокращения и условные обозначения ..................................................... 4
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................... 5
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ПОЧВЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ ............................................................................ 6
Роль почвы как глобального биогеохимического реактора .................. 6
Фиксация азота микроорганизмами в ризосфере
и ризоплане растений ................................................................................ 7
Значимость почвенных фосфатмобилизующих
микроорганизмов .................................................................................... 11
Алгоритм выделения агрономически ценных автохтонных
микроорганизмов .................................................................................... 13
Лабораторная работа 1 ........................................................................... 16
ПОДГОТОВКА К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ ........... 29
Отбор и подготовка проб почвы ............................................................ 29
Питательные среды для различных физиологических групп
микроорганизмов .................................................................................... 31
Лабораторная работа 2 ........................................................................... 34
УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И МЕТОДЫ УЧЕТА
МИКРООРГАНИЗМОВ ......................................................................... 44
Лабораторная работа 3 ............................................................................ 52
Лабораторная работа 4 ............................................................................ 58
МЕТОДЫ И ТЕХНИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
МИКРООРГАНИЗМОВ .......................................................................... 61
Лабораторная работа 5 ............................................................................ 63
Лабораторная работа 6 ............................................................................ 70
Лабораторная работа 7 ............................................................................ 73
Лабораторная работа 8 ............................................................................ 76
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................ 80
Словарь терминов и понятий .................................................................. 81
Список использованной и рекомендуемой литературы ..................... 103
3
Сокращения и условные обозначения
АТФ – аденозинтрифосфорная кислота
БАВ – биологически активные вещества
БФР – бактериальные факторы роста
ГА – глюкозо-автолизатная среда
ГМО – генетически модифицированный организм
греч. – греческий язык
КОЕ – колониеобразующая единица
лат. – латинский язык
МБП – микробиологические препараты
мол. м. – молекулярная масса
МПА – мясопептонный агар
МПБ – мясопептонный бульон
МПР – метод предельных разведений
нем. – немецкий язык
ПД – почвенное дыхание
ПДК – предельно допустимая концентрация
ППВ – полная полевая влагоемкость
ПС – питательные среды
РТ – Республика Татарстан
РФ – Российская Федерация
СМБ – суммарная микробная биомасса
США – Соединенные Штаты Америки
УФО – ультрафиолетовое облучение
франц. – французский язык
ф. р. – физиологический раствор
CO2 – углекислый газ
4
ВВЕДЕНИЕ
Микроорганизмы используются в биотехнологических процессах для различных промышленных и экологических потребностей.
Почва представляет собой поверхностный слой литосферы Земли, обладает плодородием и является природным банком различных микроорганизмов.
Предлагаемое учебно-методическое пособие способствует приобретению знаний и навыков по освоению методов изучения перспектив и возможностей почвенного микронаселения для последующего создания на основе эффективных микроорганизмов биопрепаратов комплексного действия. Основное внимание уделено выделению, отбору и
изучению автохтонных азотфиксирующих и фосфатмобилизующих
микроорганизмов. Авторами предложен алгоритм создания биопрепаратов комплексного действия на основе адаптированных к местным
условиям микроорганизмов, который позволяет сократить время для их
выделения и изучения. Изложены общие принципы работы с агрономически ценными почвенными микроорганизмами. Приводятся классические и современные методы их количественного учета, выделения, хранения эффективных штаммов с мониторингом различных свойств.
В пособии приведены теоретический материал по каждой теме, словарь
терминов и понятий.
Авторы надеются, что представленный материал будет понятен и
доступен студентам, специалистам в области биотехнологии, сельскохозяйственной микробиологии, агроэкологии и близких к ним специальностей, которые получат реальную возможность самостоятельно ставить и
решать многие методические и практические вопросы в сфере защиты
окружающей среды в целом и почвенных экосистем в частности.
5
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ
ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Роль почвы как глобального биогеохимического реактора
Почва – это своеобразная природная мембрана, регулирующая
взаимодействие между биосферой, гидросферой и атмосферой нашей
планеты. Важная роль принадлежит микробным сообществам, которые
позволяют оценить состояние почвы, определяют функционирование
экосистемы в соответствии с биогеохимическими процессами [1, 2].
Биотехнология рассматривает почву в качестве главного природного банка при поиске культур микроорганизмов с любыми необходимыми свойствами [3–6]. Для этого имеется много оснований. Современное общество заинтересовано в производстве экологически чистой продукции с наименьшими затратами и минимальным риском для окружающей среды.
Анализ основных тенденций развития сельскохозяйственной
сферы в наиболее развитых и технически оснащенных странах мира показывает все возрастающий интерес к идее биологизации, экологизации
и устойчивости земледелия. Ведущее место при этом принадлежит почвенной микробиологии, поскольку микроорганизмы являются одним из
ключевых факторов почвообразовательного процесса, питания растений и фитосанитарного состояния почвы. Исследования последних лет
существенно расширили и углубили сведения в этой области, вывели
их на молекулярный уровень. Однако представления о роли микроорганизмов ризосферы в жизни растений основаны главным образом на знании потенциальных функциональных возможностей отдельных видов и
штаммов микроорганизмов, выделенных и изученных в чистых культурах на искусственных питательных средах. Поэтому необходима разработка подходов и создание рекомендаций, позволяющих выявить биотехнологический потенциал автохтонной почвенной микрофлоры.
Известно, что коэффициенты использования растениями действующего вещества из минеральных удобрений чрезвычайно низки. Так,
усвоение минерального азота не превышает 35–50 %, фосфора – 15–
20 %, калия – 25–60 % в зависимости от почвенно-климатических условий выращивания растений [7]. Кроме того, избыточное применение
минеральных удобрений снижает разнообразие бактериальных сообществ [8] и активность почвенных бактерий, способствующих росту
растений [9, 10].
6
Одним из решений проблемы оптимизации почвенно-микробиологических процессов в агроценозах является применение микробных
препаратов различной функциональной направленности, которые позволяют создать высокую концентрацию полезных микроорганизмов в
нужном месте и в нужное время [11–19]. Применение биопрепаратов и
биоудобрений, обладающих широким спектром действия и полифункциональными свойствами, является необходимым элементом альтернативных, экологически безопасных, устойчивых систем сельского хозяйства [20–23 и др.].
В теории стабилизации микробно-растительных систем, созданной российскими учеными, описаны механизмы функциональной интеграции микроорганизмов и растений, создающие системы адаптации,
которые не существовали у партнеров до их объединения [24–28].
В данном случае речь идет о создании методов и технологий формирования, поддержания и эффективного функционирования высокоинтегрированных микробно-растительных систем, которые должны обладать максимальной степенью самодостаточности, поскольку сочетают
в себе полезные свойства не только растений, но и микроорганизмов,
возникающих только в процессе их взаимодействия. По некоторым данным, изоляты, выделенные из ризосферы, обладают высоким коэффициентом сродства к корням определенных видов растений, способностью к их колонизации [29]. Причем гомологичные штаммы обладают
большей специфичностью и более активно колонизируют корневую
зону растений.
Имеющиеся фундаментальные знания в области микробиологии
почвы и взаимодействия микроорганизмов и растений, а также накопленный опыт использования адаптированных к местным условиям микроорганизмов на практике позволяют предложить новые подходы для
повышения устойчивости агроэкосистем.
Таким образом, биологическое направление в создании препаратов для улучшения плодородия постоянно развивается, появляются новые перспективные организмы для создания на их основе биопрепаратов различного действия.
Фиксация азота микроорганизмами в ризосфере и ризоплане
растений
Азот – один из основных биогенных элементов, входящих в состав белков и нуклеиновых кислот. Несмотря на высокое содержание
7
азота в атмосфере Земли (около 78 %), он не является доступным для
ассимиляции растениями, пока не будет преобразован в аммиак, а это
требует значительного количества энергии из-за стабильности тройной
связи в N2. Дефицит азота в почве приводит к использованию большого
количества азотных удобрений, чтобы восполнить потребности растений для достижения их максимальной урожайности [30].
Почвы, где сконцентрирована основная масса микроорганизмов,
играют роль глобального биогеохимического реактора, снабжающего
биосферу доступными соединениями азота. Круговорот азота – биогеохимический цикл (рис. 1). Значительная его часть обусловлена действием живых существ. Очень большую роль в круговороте играют почвенные микроорганизмы, обеспечивающие азотистый обмен почвы – круговорот в почве азота, который присутствует там в виде простого вещества (газа N2) и ионов: нитритов (NO
+
(NH
). Концентрации этих ионов отражают состояние почвенных со-
4
-
), нитратов (NO
2
-
) и аммония
3
обществ, поскольку на эти показатели влияет состояние биоты (растений, микрофлоры), состояние атмосферы, вымывание из почвы различных веществ. Они способны снижать концентрации азотсодержащих
веществ, губительные для других живых организмов, а также переводить токсичный для живых существ аммиак в менее токсичные нитраты
и в биологически инертный атмосферный азот [31]. Следовательно,
микрофлора почвы способствует поддержанию стабильности ее химических показателей.
Азотфиксирующие прокариоты являются основными поставщиками связанного азота, так как только они одни из всего населения
Земли обладают уникальной способностью к усвоению молекулярного
азота – диазотрофии.
Физиологическая активность прокариот в 100–1000 раз выше,
чем у эукариот (растений и животных) вследствие значительно более
высокого соотношения между поверхностью и объемом. Они осуществляют свои функции в широких пределах температуры, кислотности, солености. Прокариоты отличаются от других организмов максимально
высокой скоростью размножения и способностью достичь предельной
численности за короткий промежуток времени. Совокупность этих
свойств позволяет им осуществлять функции глобального азотного реактора, за счет деятельности которого в биосфере возникают и с разной
длительностью присутствуют разнообразные азотсодержащие соединения (от предельно восстановленных до предельно окисленных), обеспечивая все другие организмы азотом в необходимой им форме.
8
Атмосферный азот N2
Денитрификация
Азотфиксация
Нитраты восстанавливают до газообразного азота бактерии, главным образом рода Pseudomonas
Атмосферный азот фиксируют
бактерии родов Azotobacter, Clos-
tridium, Rhizobium, цианобактерии и другие микроорганизмы,
затем N2 используют растения и
превращают его в растительный
белок, растения поедают животные – образуется животный белок
и т.д.
Нитрификация
Аммонификация
Аммиак окисляют до нитратов
бактерии рода Nitrosomonas, а
нитриты до нитратов – бактерии
рода Nitrobacter
Белки животных и растительных
остатков разлагают в почве микроорганизмы, например, родов
Pseudomonas, Bacillus, Clostridium. В результате образуются
аминокислоты, затем дезаминирующиеся с выделением NН3 и
других соединений
Рис. 1. Превращение микроорганизмами соединений азота [31]
Биологическая фиксация азота атмосферы остается проблемой,
значение которой возрастает и выходит далеко за рамки биологии и
сельского хозяйства. Причин тому много: производство минеральных
удобрений потребляет до трети энергии, выделяемой на сельское хозяйство в развитых странах, в том числе и в Российской Федерации (РФ), а
применение ведет к серьезному загрязнению окружающей среды, ухудшению качества сельскохозяйственной продукции, росту заболеваемости и смертности людей и животных, снижению почвенного плодородия [24, 32, 33].
9
Микробная азотфиксация играет ключевую роль в балансе азота
в биосфере и по своей значимости для живой природы сравнима только
с другим глобальным процессом – фотосинтезом [34]. При активизации
биологической фиксации азота в растения поступает дополнительно
20–30 кг минеральных азотных удобрений. Кроме того, повышается
продуктивное использование растениями азота удобрений из почвы, а
также снижаются потери азота.
Дополнительным источником азотного питания культурных растений может быть использование биологического потенциала азотфиксирующих микроорганизмов, способных обеспечить доступным азотом
не только себя, но и население планеты. Поэтому среди различных
форм микробной азотфиксации основное значение в биосфере имеет ассоциативная.
Согласно современным представлениям несимбиотические диазотрофы – это микроорганизмы, образующие ассоциации на корнях
небобовых растений. При этом создается целостная система, способная
часть энергии фотосинтеза направлять на процесс превращения атмосферного азота в доступные для растения азотистые соединения. Ассоциативные микроорганизмы обладают многочисленными функциями:
они способны увеличивать растворимость почвенных фосфатов, продуцировать физиологически активные вещества, ингибировать развитие
патогенной микрофлоры через выделение антибиотиков, стимулировать прорастание семян и др. [24, 35–38].
Активность азотфиксации сопряжена с фотосинтетической деятельностью [39]. Установлено, что уровень активности фотосинтеза
многих растений вызывает активизацию ризосферных микроорганизмов, обеспечивая их комплексом веществ, необходимых для оптимального осуществления процессов их жизнедеятельности.
Особенности видового состава и количества микроорганизмов зависит от растения. В табл. 1 приведены данные литературы о численности диазотрофов в ризосфере различных сельскохозяйственных растений.
К настоящему времени диазотрофия обнаружена практически у
всех групп прокариот – у фототрофов, хемолитотрофов и гетеротрофов,
у аэробов, анаэробов и микроаэрофилов, у трихомных, почкующихся и
мицелиальных микроорганизмов, у эубактерий и архей [14, 15, 17, 19,
34 и др.].
10
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]