Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов. Учебно-методическое пособие
.pdf
затем инкубируют в течение 7 сут в темноте при комнатной температуре (22 °С).
Необходимо помнить, что для дальнейшего изучения автохтонных микроорганизмов с целью создания на их основе биопрепарата используют только те почвенные образцы, в которых количество диазотрофных и фосфатмобилизующих микроорганизмов составляет 5–15 %
от общей численности микроорганизмов гетеротрофного блока.
Питательные среды для различных физиологических групп
микроорганизмов
Микробиологические показатели почв можно объединить в несколько групп: общая численность выделяемых на среды микроорганизмов; плотность популяций отдельных видов/родов, физиологических групп; состав и разнообразие микробных сообществ/комплекса;
биомасса грибов и бактерий; активность ферментов и микробиологических процессов.
Как правило, используют несколько методов или показателей, которые обеспечивают решение поставленной задачи. Необходимо исходить из следующих критериев: чувствительность, вариабельность получаемых результатов, сложность метода и длительность анализа, возможность его применения на разных почвах только в лабораторных
условиях или также и в поле (универсальность), селективность в определении разных типов почв [59, 60].
Для осуществления всех жизненных процессов микробной клетки
(рост, развитие, размножение) необходимы определенные условия, в
первую очередь питательные вещества, из которых синтезируются составные части микроорганизмов. Из питательных веществ, поступивших в клетку, синтезируются белки, углеводы, липиды, ферменты, токсины и другие соединения. Процессы питания тесно связаны с дыханием. При питании клетка получает строительный и энергетический материал, а в процессе дыхания образуется энергия, необходимая для ее
жизни.
Питательными средами (ПС) называют субстраты, которые состоят из питательных веществ, обеспечивающих необходимые условия
для роста и развития биологических объектов и/или накопления продуктов их жизнедеятельности. Все вещества в составе ПС должны находиться в легко усвояемой для культивируемых организмов форме и в
количествах, соответствующих их специфическим потребностям. В
31
питательных средах, которые должны быть изотоническими и стерильными, поддерживается определенная реакция среды, оптимальная для
культивируемых организмов (диапазон рН может быть 4,0–9,0, но чаще
используют нейтральные или слабощелочные среды) и достаточная
влажность, обеспечивающая возможность диффузии питательных веществ.
Питательные среды классифицируют по составу, консистенции и
назначению.
Классификация питательных сред по составу. По составу их
делят на натуральные, полусинтетические, синтетические. Натураль-
ные среды, которые готовят с использованием натуральных субстратов –
продуктов животного или растительного происхождения, являются средами сложного, неопределенного и непостоянного состава. В качестве
источника углерода и энергии в них включают крахмал, солод или мелассу, в качестве источников азота, серы, фосфора и аминокислот – ферментированные, кислотные или щелочные белковые гидролизаты (пептоны из казеина, соевого белка, мяса или рыбы) либо кукурузный экстракт; для обеспечения аминокислотами, пептидами, углеводами и водорастворимыми витаминами и микроэлементами в состав среды добавляют дрожжевой экстракт. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов и для накопления их биомассы. Для приготовления полусинтетических сред
наряду с натуральными субстратами используются химически чистые
соединения в определенных концентрациях (среды на основе картофельного отвара с глюкозой или сахарозой). Синтетические среды
имеют строго определенный состав, их готовят из химически чистых
соединений, взятых в строго определенных концентрациях. Эти среды
наиболее удобны для изучения особенностей метаболизма микроорганизмов и их потребностей в питательных веществах. В большинстве
случаев синтетические среды готовят на водопроводной воде и микроэлементы не добавляют, так как они в небольших количествах всегда
содержатся в водопроводной воде и могут поступать в среду из стекла
посуды. В специальных целях для приготовления синтетических сред
используют дистиллированную воду. В этом случае микроэлементы вносят в среду обязательно.
Классификация питательных сред по консистенции. По кон-
систенции питательные среды делят на жидкие, полужидкие, плотные,
сыпучие. Жидкие ПС представляют собой растворы питательных веществ для культивируемых организмов, приготовленные из
32
синтетических или природных компонентов. Полужидкие – среды, приготовленные на основе жидких ПС с добавлением уплотнителя (0,3–
0,7 % агара), они пригодны для культивирования микроаэрофильных
бактерий, а также для изучения подвижности клеток и хемотаксиса.
Плотные – среды, приготовленные на основе жидкой ПС с добавлением
уплотнителя: 1,0–2,0 % агара, 17,0–20,0 % желатина, 1,5–2,0 % силикагеля. Их используют для выделения чистой культуры, описания морфологии колоний, подсчета их количества и др. Сыпучие среды для выращивания микроорганизмов готовят на основе твердых компонентов
(разваренного пшена, отрубей), они используются для выращивания
мицелиальных грибов.
Классификация питательных сред по назначению. По назначе-
нию питательные среды разделяют на универсальные (основные), селективные (элективные, накопительные, избирательные), среды обогащения и дифференциально-диагностические. На универсальных средах
хорошо растут патогенные и непатогенные микроорганизмы (мясопептонный бульон – мясная вода, 1,0 % пептона, 0,5 % NaCl), на их основе
готовят сложные среды. Селективные среды служат для выделения
определенной физиологической группы микроорганизмов, поскольку
обеспечивают интенсивный рост одного или нескольких близких видов
микроорганизмов и подавляют рост посторонней микрофлоры. При выделении грамотрицательных бактерий в питательную среду добавляют
кристаллический фиолетовый или малахитовый зеленый, соли желчных
кислот, которые подавляют рост грамположительной микрофлоры.
В средах обогащения создаются условия, благоприятные для роста того
или иного из присутствующих в смеси микроорганизмов, но в их состав
обычно не входят подавляющие рост микроорганизмов вещества. Диф-
ференциально-диагностические среды содержат индикатор, меняющий
цвет среды при изменении ее реакции в результате образования продуктов расщепления веществ, а также определенное соединение, отношение к которому является диагностическим признаком для данного организма. Существуют и среды, сочетающие свойства селективных и дифференциально-диагностических сред.
При составлении сред следует обязательно учитывать особенности обмена веществ микроорганизмов. Для качественной и количественной характеристики микрофлоры почвы чаще всего используют
элективные среды. Количество питательных сред, используемых в разных отраслях микробиологии и медицины, достигает 1500 видов [59,
61].
33
Следовательно, благодаря подбору сред можно идентифицировать родовой и видовой состав микроорганизмов, необходимых для
дальнейшего создания на них бактериальных удобрений.
Лабораторная работа 2
ЭЛЕКТИВНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА
ДИАЗОТРОФНЫХ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель работы: ознакомить студентов с основными питательными
средами для выделения диазотрофных и фосфатмобилизующих микроорганизмов, принципами их приготовления, способами стерилизации.
Оборудование, материалы и реактивы:
– автоклав;
– аквадистиллятор;
– весы аналитические с точностью взвешивания до 0,01 г;
– стерилизатор воздушный;
– термостат;
– рН-метр с погрешностью измерения ±0,1 рН;
– стерильные чашки Петри;
– колбы мерные на 500 и 1000 мл;
– колбы на 250 и 1000 мл;
– цилиндры мерные;
– пробирки;
– пробки;
– дозатор на 0,1 и 1,0 мл;
–наконечники;
– реактивы для приготовления питательных сред;
– спиртовки;
– штативы;
– шпатели;
– вата;
– спички и др.
Основой выделения автохтонных почвенных микроорганизмов
является применение элективных питательных сред. В зависимости от
физиологических особенностей изучаемых микроорганизмов применяют твердые, полужидкие и жидкие питательные среды.
34
Ход работы
Приготовление питательных сред. Выделение диазотрофных
микроорганизмов проводят на следующих средах [24, 62]:
1. Сложная среда (г/л):
K2HPO4 – 0,5;
MgSO4×7H2O – 0,3;
СаCl2×6H2O – 0,1;
NaCl – 0,5;
FeCl3×6H2O – 0,01;
глюкоза – 1,0;
лактат кальция C6H10CaO6 – 1,0;
ацетат кальция Ca(CH3COO)2 – 1,0;
пептон – 1,0;
дрожжевой автолизат – 0,1;
агар-агар – 20,0;
вода водопроводная.
Стерилизация при 0,5 атм.
2. Среда Федорова (г/л):
K2HPO4 – 0,3;
CaHPO4 – 0,2;
MgSO4×7H2O – 0,3;
K2SO4 – 0,2;
NaCl – 0,5;
FeCl3×6H2O – 0,1;
СаСО3 – 5,0;
маннит – 20,0;
агар-агар – 20,0;
смесь микроэлементов – 1,0 мл;
вода дистиллированная.
Стерилизация при 1 атм.
Смесь микроэлементов по Федорову (г/л):
H3BO3 – 5,0;
(NH4)2MoO4 – 5,0;
KI – 0,5;
NaBr – 0,5;
35
ZnSO4×7H2O – 0,2;
Al2(SO4)3×18H2O – 0,3;
вода дистиллированная.
Стерилизация при 1 атм.
3. Среда Эшби (г/л):
K2HPO4 – 0,2;
MgSO4×7H2O – 0,2;
NaCl – 0,2;
KH2PO4 (или К2SO4) – 0,1;
CaCO3 – 5,0;
сахароза (или манит) – 20,0;
агар-агар – 20,0;
вода водопроводная, рН – 7,0.
Стерилизация при 0,5 атм.
4. Среда Эшби модифицированная (%):
K2HPO4 – 0,02;
MgSO4×7H2O – 0,02;
NaCl – 0,02;
K2SO4 – 0,01;
СаСО3 – 0,5;
бромтимоловый синий (5 % спиртовый раствор) – 0,2 мл/л;
микроэлементы по Федорову – 1,0 мл/л;
арабиноза (или сахароза, или глюкоза) – 0,05–0,5;
вода водопроводная, рН – 7,0.
Стерилизация при 0,5 атм.
5. Среда Бэрка (г/л):
сахароза – 20,0;
K2HPO4 – 0,64;
KH2PO4 – 0,16;
MgSO4×7H2O – 0,2;
NaCl – 0,2;
CaSO×2H2O – 0,05;
Na2MoO4 – 0,001;
FeSO4 – 0,003;
вода дистиллированная.
Стерилизация при 0,5 атм.
36
6. Среда Доберейнер – среда Д (г/л):
KH2PO4 – 0,4;
K2HPO4 – 0,1;
MgSO4×7H2O – 0,2;
NaCl – 0,1;
СаCl2×2H2O – 0,1;
FeCl3×6H2O – 0,01;
Na2MoO4×2H2O – 0,002;
α-яблочная кислота – 0,5;
агар-агар – 0,15;
вода дистиллированная, рН – 6,5 (регулирование рН среды –
КОН);
индикатор – 0,5 % спиртовый раствор бромтимолового синего –
5,0 мл;
Стерилизация при 0,5 атм.
Инкубирование проводят в течение 7–14 сут при 26 °С с дальней-
шим пересевом на среду ДN (г/л):
KH2PO4 – 0,4;
K2HPO4 – 0,1;
MgSO4×7H2O – 0,2;
NaCl – 0,1;
СаCl2×2H2O – 0,02;
FeCl2×6H2O – 0,01;
Na2MoO4×2H2O – 0,002;
α-яблочная кислота – 2,5;
NH4Cl – 0,013;
агар-агар – 2,0;
0,5% спиртовый раствор бромтимолового синего – 5,0 мл;
вода дистиллированная, рН – 6,5 (регулирование рН среды –
КОН).
Стерилизация при 0,5 атм.
8. Среда Виноградского (г/л):
K2HPO4 – 1,0;
MgSO4×7H2O – 0,5;
MnSO4 – 0,01;
NaCl – 0,01;
FeSO4 – 0,01;
СаСО3 – 20,0;
37
глюкоза – 20,0;
вода дистиллированная.
Стерилизация при 0,5 атм.
9. Среда Федорова – Калининской (г/л):
K2HPO4 – 1,74;
KH2PO4 – 0,91;
MgSO4×7H2O – 0,3;
NaCl – 0,5;
СаCl2×6H2O – 0,1;
FeCl3×6H2O – 0,01;
агар-агар – 20,0;
смесь микроэлементов по Федорову – 1,0 мл;
вода дистиллированная.
Стерилизация при 1 атм.
10. Среда малатная (г/л):
минеральная основа по среде Федорова – Калининской;
малат натрия C4H4Na2O5 – 5,0;
смесь витаминов – 1,0 мл;
агар-агар – 15,0.
Стерилизация при 0,5 атм.
Смесь витаминов (мкг/мл):
биотин (витамин Н или B7) – 10,0;
цианкобаламин (витамин В12) – 2,0;
рибофлавин (витамин B2) – 200,0;
тиамин (витамин B1), пиридоксин (витамин B6), пантотенат кальция (витамин B5), никотиновая (витамин РР) и парааминобензойная
кислота (витамин Н) – по 100,0;
вода дистиллированная.
Стерилизация при 0,5 атм.
11. Глюкозо-автолизатная среда – ГА (г/л):
глюкоза – 10,0;
дрожжевой автолизат – 0,06;
K2HPO4 – 1,74;
KH2PO4 – 0,91;
MgSO4×7H2O – 0,3;
38
NaCl – 0,5;
СаCl2×6H2O – 0,1;
FeCl3×6H2O – 0,01;
смесь микроэлементов по Федорову – 1,0 мл;
смесь витаминов – 1,0 мл;
бромтимоловый синий – 0,01–0,02;
вода дистиллированная, рН – 7,0.
Стерилизация при 0,5 атм.
12. Полужидкая безазотная среда с сахарозой и витаминами –
среда С (г/л):
сахароза – 5,0;
минеральный состав, как в среде ГА;
смесь витаминов – 1,0 мл;
агар-агар – 4,0.
Стерилизация при 1 атм.
13. Полужидкая безазотная среда с малатом – среда ДМ, или сук-
цинатом – среда ДС (г/л):
сукцинат натрия Na2C4H4O4 – 5,0;
K2HPO4 – 1,74;
KH2PO4 – 0,91;
MgSO4×7H2O – 0,3;
NaCl – 0,5;
СаCl2×6H2O – 0,1;
FeCl3×6H2O – 0,01;
смесь микроэлементов по Федорову – 1,0 мл;
смесь витаминов – 1,0 мл;
агар-агар – 4,0;
вода дистиллированная.
Стерилизация при 0,5 атм.
14. Сахарно-картофельная среда (г/л):
СаСО3 – 0.05-0.1 г и ломтики картофеля внести на дно пробирки.
После этого добавить 15 мл среды следующего состава:
сахароза – 10,0;
K2HPO4 – 1,74;
KH2PO4 – 0,91;
MgSO4×7H2O – 0,3;
СаCl2×6H2O – 0,1;
39
FeCl3×6H2O – 0,01;
смесь микроэлементов по Федорову – 1,0 мл;
вода дистиллированная.
Стерилизация при 0,5 атм.
15. Полужидкая малатная среда Доберейнер в модификации Ка-
лининской (г/л):
яблочно-кислый Na – 0,05;
K2HPO4 – 1,74;
KH2PO4 – 0,91;
NaCl – 0,05;
агар-агар – 4,0;
MgSO4×7H2O – 0,03;
СаCl2×6H2O – 0,01;
FeCl3×6H2O – 0,001;
смесь микроэлементов по Федорову – 1,0 мл;
смесь витаминов – 1,0 мл;
бромтимоловый синий (5 % спиртовый раствор) – 0,2 мл;
вода дистиллированная.
Стерилизация при 0,5 атм,
16. Картофельный агар (%):
экстракт, полученный из 200 г картофеля в 1 л среды;
яблочно-кислый натрий – 0,25;
нерафинированный сахар – 0,25;
биотин – 100,0 мкг/л среды;
пиридоксин – 200,0 мкг/л среды;
агар-агар – 2,0;
вода дистиллированная, рН – 7,0.
Стерилизация при 0,5 атм.
17. Среда с конго красным (%):
K2HPO4 – 0,05;
MgSO4×7H2O – 0,02;
NaCl – 0,01;
дрожжевой экстракт – 0,05;
FeCl3×6H2O – 0,0015;
яблочно-кислый натрий – 0,5;
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]