Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов. Учебно-методическое пособие
.pdf
Таблица 1
Растение
Диазотрофы
Численность,
×103 КОЕ/ г почвы
Овес
Azotobacter
45,0
Пшеница
Azospirillum
2,0
Пшеница
Azospirillum
99,0
Пшеница
Azotobacter
0,1
Кукуруза
Azotobacter
25,0
Кукуруза
Azotobacter
2500,0
Сахарная свекла
Azotobacter
5,0
Амарант
Azotobacter,
Azospirillum
1800,0–12800,0
Численность диазотрофных микроорганизмов
в ризосфере сельскохозяйственных культур [24]
При биологической фиксации азота увеличивается урожай последующей культуры в севообороте, улучшается плодородие почвы. Поэтому ассоциативные азотфиксаторы относятся к числу агрономически
значимых групп, а прикорневая зона растений является наиболее благоприятной средой для их размножения.
Очевидно, что именно ассоциативные диазотрофы, развивающиеся в ризосферном симбиозе с зерновыми, кормовыми культурами
представляют наибольший интерес для исследователей, поскольку они
могут служить переходными формами к созданию азотфиксирующих
симбионтов важнейших сельскохозяйственных растений.
Значимость почвенных фосфатмобилизующих
микроорганизмов
Кларк минерального фосфора – одного из главных элементов, необходимых для роста и развития растений, в земной коре невысокий
(около 0,1 %). В свободном состоянии фосфор в литосфере не встречается, он вовлекается в глобальную циркуляцию путем выщелачивания
и растворения континентальными водами.
В настоящее время проблема фосфора в земледелии является одной из самых острых, так как фосфор находится в почве в основном в
водонерастворимой форме в виде разнообразных минеральных соединений, в основе которых лежат ортофосфаты кальция, железа и
11
алюминия. Большая группа почвенных фосфатов, малодоступных растениям, представлена органическими соединениями. Кроме того возделывание сельскохозяйственных культур сопровождается выносом из
почвы 25–40 кг оксида фосфора на гектар пахотного слоя, что требует
систематического внесения удобрений. Однако усвояемость сельскохозяйственными культурами фосфорных удобрений не превышает 25 %,
так как подавляющее его количество фиксируется почвой, превращаясь
в недоступные для растений фосфаты [40, 41].
В круговороте фосфора существенную роль играют микроорганизмы, которые способствуют его поступлению в растения [12, 13, 16, 42].
Их видовой состав достаточно обширен: Bacillus intermedius,
Sphingobacterium multivorum Achromobacter xylosoxidans и многие другие.
Фосфатмобилизующие микроорганизмы способны извлекать
фосфор из его водонерастворимых соединений и транспортировать в
растение. Возвращающиеся в почву органофосфаты подвергаются микробной деструкции и превращаются в минеральные ортофосфаты, доступные для усвоения автотрофами. Фосфатмобилизующие микроорганизмы способны также подавлять фитопатогенные грибы и бактерии,
улучшать плодородие почвы, синтезировать регуляторы роста растений, влиять на прорастание семян и развитие проростков [43, 44].
Если в почве имеется дефицит доступного для растений фосфора,
то инокуляция биопрепаратами обеспечивает этим элементом питания
практически все сельскохозяйственные культуры в количестве, соответствующем внесению на гектар 40–50 кг действующего вещества, которое содержится в 120–150 кг минеральных фосфорных удобрений
Если в почве не хватает и фосфора, и азота, а именно так чаще
всего и бывает, то применяют двойную инокуляцию растений азотфиксирующими и фосфатмобилизующими микроорганизмами.
Если в почве имеется дефицит азота, то инокуляция сельскохозяйственных культур обеспечивает растения азотом в количестве, соответствующем внесению на гектар 40–50 кг действующего вещества, что
соответствует внесению 100–120 кг минеральных азотных удобрений
[45].
Таким образом, возросла актуальность разработки альтернативных путей для улучшения минерального питания растений. Одним из
них является использование комплексных биопрепаратов, созданных на
основе эффективных штаммов микроорганизмов, способных к мобилизации атмосферного азота и фосфора почв.
12
Алгоритм выделения агрономически ценных автохтонных
микроорганизмов
Одной из важнейших задач современной биотехнологии в сельском хозяйстве является выявление микроорганизмов, способных существенно расширить возможности растений, придать им новые свойства и тем самым добиться максимальной эффективности. В сельском
хозяйстве активно используются биоудобрения на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов).
Под термином микробиологические препараты (МБП) понимают
различные препаративные формы субстрата-носителя, содержащего в
достаточном для обеспечения заданных функций количество (концентрацию, титр) культуры (технологичных штаммов) полезных живых
микроорганизмов и жизнеспособных спор, а также продукты их метаболизма. Все иные препараты, содержащие полезные для растений продукты метаболизма (антибиотики, витамины, стимуляторы роста и др.),
выработанные микроорганизмами (также и сами отмершие ткани микробов) правильнее называть веществами микробиологической природы
[20]. Ведущими функциональными видами МБП для земледелия являются микробиологические удобрения, фунгициды, стимуляторы роста,
ризобиальные препараты для бобовых культур.
С точки зрения современных агротехнологий представляет интерес применение в сельскохозяйственном производстве биопрепаратов
комплексного действия, обладающих несколькими видами полезной активности – азотфиксирующей, фосфатмобилизующей, фунгицидной,
рострегулирующей, позитивным действием на показатели плодородия
почвы [5, 24, 46-48 и др.]. В связи с этим перспективным и актуальным
является поиск эффективных региональных азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для создания на их основе биоудобрений.
Сложностью при создании комбинированных препаратов является разнообразие видового состава микроорганизмов, требующих подбора индивидуальных питательных сред, условий культивирования,
стабилизации готового продукта и т.д.
Метод познания того или иного предмета представляет собой
комплекс мер по решению определенной задачи. Предлагаемый алгоритм (рис. 2) позволяет сократить время для выделения сельскохозяйственно значимых штаммов аборигенной микрофлоры, оценить их
13
биотехнологический потенциал и в дальнейшем использовать наиболее
эффективные из них в качестве основы создаваемых биопрепаратов.
Основные критерии при отборе почвенных азотфиксирующих и
фосфатмобилизующих микроорганизмов, найденных в естественных
условиях конкретной агроклиматической зоны:
– высокая скорость накопления биомассы индивидуальных штаммов;
– высокая нитрогеназная активность;
– способность подавлять развитие фитопатогенных микромицетов;
– выявление способности к синергическому взаимодействию при
создании биоудобрений на основе консорциума диазотрофных и фосфатмобилизующих микроорганизмов;
– увеличение всхожести и энергии прорастания семян тест-культур, а также биомасса проростков и корешков, их длина при обработке
консорциумом азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов в лабораторных опытах;
– сохранение жизнеспособности и уровня активности при различных температурных режимах, сроках хранения и т.д.
Практическое использование биопрепаратов требует увеличения
сроков их хранения. Одним из подходов для решения этой проблемы
является использование минеральных (бентонит, вермикулит, глауконит, фосфорит, цеолит) и органоминеральных (сапропель) компонентов
в нативном и наноструктурном виде, так как эти вещества одновременно могут быть сорбентами и протекторами коллекционных микроорганизмов.
Достоинством применения биопрепаратов на основе эффективных автохтонных диазотрофных и фосфатмобилизующих микроорганизмов является снижение доз используемых азотных и фосфорных
удобрений, повышение урожайности бактеризованных растений и
устойчивости их к вредителям и болезням.
14
15 16
Лабораторная работа 1
ИНСТРУКТАЖ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ,
ОЗНАКОМЛЕНИЕ С РАБОТОЙ ПРИБОРОВ
Цель работы: провести инструктаж по технике безопасности,
ознакомить с работой автоклава, ламинар-бокса, хроматографа, термостата, стерилизатора, аквадистиллятора и других приборов.
Оборудование, материалы и реактивы:
– автоклав (рис. 3);
– аквадистиллятор (рис. 4);
– весы аналитические с точностью взвешивания до 0.01 г;
– ламинар-бокс (рис. 5);
– стерилизатор воздушный (рис. 6);
– термостат (рис. 7);
– хроматограф газовый (рис. 8);
– рН-метр с погрешностью измерения ±0.1 рН и др.
При работе в бактериологической лаборатории преподаватель
знакомит студентов с общими правилами поведения, которые необходимо знать, чтобы избежать травматизма и несчастных случаев, а также
с правилами работы и уходом за оборудованием.
Ход работы
Правила поведения и работы в бактериологической лаборатории. К работе в микробиологической лаборатории допускаются лица,
получившие первичный инструктаж и не имеющие медицинских противопоказаний. Нельзя входить в лабораторию в пальто, головном
уборе, вносить посторонние вещи, принимать пищу. Следует соблюдать правила использования оборудования, поддерживать чистоту в лаборатории: содержать в порядке рабочее место, мыть руки.
Требования безопасности при подготовке к работе:
– приступить к занятиям, надев хлопчатобумажный белый халат
или спецодежду.
– протереть рабочую поверхность стола и руки дезинфицирующим раствором (60–70 % спирт или 3 % раствор хлорамина);
– подготовить к работе горелки, спиртовки заправить спиртом и
проверить фитиль;
– проверить наличие средств пожаротушения.
Требования безопасности во время работы:
– соблюдать чистоту и аккуратность в работе;
– соблюдать правила обращения с химическими реактивами и
красителями;
– не хранить спирт и эфир рядом с горелками;
– не допускать распыления микроорганизмов, особенно спор грибов, являющихся аллергенами, т. е. не оставлять открытыми чашки
Петри, пробирки, колбы с культурами микроорганизмов;
– проводить в ламинар-боксе или боксе работы по высевам или
пересевам культур микроорганизмов;
– закрывать чашки Петри, пробирки, колбы с культурой;
– пользоваться пинцетами, шпателями и другими соответствующими инструментами, подлежащими затем обеззараживанию – фламбированию, кипячению, автоклавированию и др.;
– переносить жидкие пробы с заразным материалом из одного сосуда в другой над приемником, в котором находится дезинфицирующая
жидкость;
– хранить в холодильнике пробы образцов в упакованном виде с
четкими надписями;
– погружать в дезинфицирующий раствор (3–5 % раствор хлорамина) отработанные препараты после микроскопирования;
– собирать в специальные емкости (банки, ведра с крышками
и т.д.) предметы, подлежащие обеззараживанию;
– стерилизовать использованные предметы и материалы в дезинфицирующих жидкостях или в сушильном шкафу, автоклаве и др.
Делать в работе перерывы через 30–45 мин.
Требования безопасности по окончании работы:
– помнить о том, что студенты несут ответственность за используемые приборы, лабораторное оборудование;
– использованные пипетки, шпатели, предметные стекла до мытья и стерилизации поместить в дезинфицирующий раствор (3–5 % раствор хлорамина) на несколько часов;
– не оставлять пробы анализируемых веществ на рабочих местах;
– протирать иммерсионный объектив микроскопа мягкой тканью,
накрывать микроскоп полиэтиленовым чехлом;
– убирать в специальную емкость с крышкой разбитую посуду,
использованные питательные среды;
17
– дезинфицировать посуду, рабочее место, перчатки, фартук 3-5%
раствором хлорамина, обработать спиртом рабочий стол в боксе;
– после работы с микроорганизмами вымыть руки с мылом, продезинфицировать спиртом, а затем смазать глицериново-спиртовой
смесью;
– провести тщательную уборку помещений лаборатории влажным способом с применением дезинфицирующих жидкостей;
– перед уходом из лаборатории дежурному проверить, выключены ли электроприборы, вода, газ и др.;
– провести стерилизацию воздуха и оборудования в помещении
лаборатории бактерицидными лампами при отсутствии людей.
Требования безопасности в аварийных ситуациях:
– при разбрызгивании культуральной жидкости провести ее
уборку с помощью ваты, смоченной дезинфицирующим раствором (60–
70 % спирт или 3–5 % раствор хлорамина).
– при химических ожогах 1 и 2 степеней обожженное место присыпать двууглекислым натрием либо сделать примочку из 2 % раствора
двууглекислого натрия или 5 % раствора марганцево-кислого калия;
– при ожогах химическими веществами пораженный участок
кожи промыть большим количеством воды, сделать примочку: при ожогах кислотами – из 2 % содового раствора, а при ожогах щелочами – из
слабого раствора уксусной кислоты.
Телефоны экстренных служб:
Пожарная служба – 01, 010 – для мобильного телефона.
Скорая помощь – 03, 030 – для мобильного телефона.
Ознакомление с работой автоклава
Автоклав (рис. 3) – аппарат, который используется для стерили-
зации питательных сред, растворов и т. д. насыщенным паром под давлением.
18
Рис. 3. Схема устройства вертикального автоклава:
1 – стерилизационная камера; 2 – кран для выхода воздуха;
3 – манометр; 4 – предохранительный клапан; 5 – водопаровая
камера; 6 – воронка для заполнения автоклава водой; 7 – отверстия
для поступления в камеру пара; 8 – крышка автоклава
Порядок работы автоклава. Основу автоклава представляет металлический двустенный котел, способный выдержать высокое давление. Во внутреннюю часть, которая называется стерилизационной камерой 1, помещают объекты для стерилизации. Стерилизационная камера соединена с краном 2 для выхода воздуха, манометром 3 для определения давления, а также снабжена предохранительным клапаном 4,
обеспечивающим выход пара при повышении давления больше разрешенного. Пространство между стенками котла, называемое водопаровой камерой 5, перед автоклавированием через воронку 6 заполняется
дистиллированной водой до уровня на водомерной трубке 7. Пар поступает в стерилизационную камеру через специальные отверстия 8. Снаружи паровой котел покрыт защитным кожухом 9. Автоклав плотно закрывают массивной крышкой 10. Предметы перед стерилизацией помещают на специальную подставку в стерилизационной камере.
19
Стерилизация насыщенным паром под давлением – один из
Давление, атм
Температура, °С
Нормальное
Добавочное
1.0 - 100
1.0
0.5
112
1.0
0.6
114
1.0
0.7
116
1.0
0.8
117
1.0
1.0
121
1.0
1.5
128
1.0
2.0
134
наиболее эффективных методов, основанный на прогревании субстрата
насыщенным паром в автоклавах (табл. 2).
Таблица 2
Температура насыщенного пара при различных давлениях [49]
В результате совместного действия высокой температуры и пара
обеспечивается надежность стерилизации: при автоклавировании погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. В случае, если
стерилизация проводится при высокой температуре, но без давления,
используют стерилизатор или сушильный шкаф.
Из термических способов, помимо автоклавирования, применяют
стерилизацию текучим паром, тиндализацию и кипячение.
Ознакомление с работой аквадистиллятора. Аквадистиллятор
электрический ДЭ-10 (рис. 4) предназначен для производства дистиллированной воды, отвечающей требованиям СанПин 2.1.4.1074-01 [50].
Вода, нагреваемая электронагревателями в камере испарения, превращается в пар, который поступает по патрубку в конденсатор, где, охлаждаясь, конденсируется и сливается в виде дистиллята через штуцер в
подставленный сосуд.
Порядок работы аквадистиллятора следующий. Надеть на штуцер
резиновую трубку и опустить в сосуд для сбора дистиллированной
воды. Открыть кран водопровода для подачи воды в аквадистиллятор.
Включить аппарат в электросеть. Установить тумблер на электрощите
в положение «включено» (при этом загорится сигнальная лампа
«сеть»). К моменту достижения необходимого уровня воды в камере испарения поплавок датчика уровня замкнет контакты реле и тем самым
включит в сеть электронагреватели (при этом загорится сигнальная
лампа «аппарат включен»).
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]