Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов. Учебно-методическое пособие
.pdf
аналогичны, второй широко применяют для моделирования и изучения
азотфиксации. Если в газовой среде присутствуют одновременно N2 и
С2Н2, то в первую очередь произойдет восстановление ацетилена вследствие большего сродства электронов к атому углерода.
Используют несколько вариантов ацетиленового метода:
1) отбор проб почвы (воды, других анализируемых субстратов
или чистой культуры микроорганизма) с последующей инкубацией в
атмосфере ацетилена;
2) способ почвенных монолитов, при котором часть почвы (с растением или без него) инкубируют с ацетиленом в газонепроницаемом
контейнере;
3) полевой диффузионный метод «колпаков», заключающийся в
том, что поверхность почвы накрывают газонепроницаемым колпаком,
под который вводят ацетилен;
4) выдерживание монолита почвы с растением в продуваемой через почву ацетилено-воздушной смеси.
Во всех случаях ацетилен вводят в воздушное пространство в количестве 10 % от объема сосуда, или «колпака», или с заведомым избытком.
Применение ацетиленового метода в полевых условиях сопряжено с некоторыми сложностями: введение в почву ацетилена может
сопровождаться его адсорбцией или, напротив, затрудненной диффузией. Образующийся этилен также способен адсорбироваться почвой, а
при отсутствии ацетилена, напротив, выделяться ею. В герметичной камере, особенно при длительной экспозиции, возникает парниковый эффект – увеличение концентрации СО2 в составе газовой смеси, следствием чего является активизация фотосинтеза, в результате чего усиливается отток корневых выделений, способствующий повышению активности микроорганизмов. Кроме того, может учитываться азотфиксация не только в почве и ризосфере, но и в филлосфере растений.
Ход работы
Среду Бэрка в количестве 3,0 мл разливают в пенициллиновые
флаконы, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве. Затем производят посев 2,0 мл культуральной жидкости во флаконы. После инкубации, которую проводят в течение 4 сут, ватные пробки заменяют на резиновые (стерилизация проводится кипячением в воде в течение 20 мин) и закрепляют их металлическими зажимами. Затем
71
эвакуируют воздух и с помощью инъекционной иглы через резиновую
пробку вводят ацетилен в количестве 10 % от объема флакона. Инкубация с ацетиленом 1 ч. При наличии в среде активной нитрогеназы ацетилен восстанавливается до этилена. Количество этилена, образующегося в течение этого периода, определяют на газовом хроматографе
(рис. 8). В пробах после определения этилена устанавливают титр чистых культур микроорганизмов путем подсчета в камере Горяева [74].
Обработка результатов
Расчет активности азотфиксации проводят по формуле [73]
фР
Ра
ст
,
где S и Sст – площади пиков этилена в образце и стандарте соответственно;
Vф – объем флакона, см3;
Vn – объем суспензии, см3.
Подсчет клеток проводят в камере Горяева по формуле
,
где M – число клеток в 1,0 мл суспензии;
A – среднее число клеток в квадрате сетки;
h – глубина камеры, мм;
S – площадь квадрата, мм2;
N – разведение исходной суспензии.
При подсчете в малых квадратах
.
При подсчете в больших квадратах
.
72
Контрольные вопросы
1. Перечислите основные блоки газового хроматографа.
2. Приведите формулировку азотфиксации биологической.
3. Что представляет собой ацетиленовый метод определения азот-
фиксирующей активности?
4. В чем состоят сложности проведения ацетиленового метода в
полевых условиях?
5. Как устроена камера Горяева?
6. Проанализируйте результаты, полученные при подсчете мик-
роорганизмов в камере Горяева.
7. Интерпретируйте данные, полученные при определении нитрогеназной активности у диазотрофных и фосфатмобилизующих микроорганизмов.
Лабораторная работа 7
ИЗУЧЕНИЕ ХАРАКТЕРА ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ШТАММОВ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель работы: изучить характер взаимоотношения штаммов и
определить антагонистическую активность автохтонных микроорганизмов.
Оборудование, материалы и реактивы:
– автоклав;
– термостат;
– стерилизатор воздушный;
– весы аналитические с точностью взвешивания до 0,01 г;
– рН-метр с погрешностью измерения ±0,1 рН;
– аквадистиллятор;
– стерильные чашки Петри;
– колбы мерные на 500 и 1000 мл;
– колбы на 250 и 1000 мл;
– цилиндры мерные;
– пробирки;
– пробки;
– дозатор на 0,1 и 1,0 мл;
– наконечники;
73
– реактивы для приготовления питательных сред;
– пробочное сверло диаметром 8 мм;
– спиртовки;
– шпатели;
– штативы;
– бактериологические петли;
– спички и др.
Характер взаимоотношения штаммов азотфиксирующих и фос-
фатмобилизующих микроорганизмов между собой определяют методом перпендикулярных штрихов и блоков [75]. Антагонистическую
способность исследуют методом лунок и штрихов [76, 77]. Метод лунок
позволяет оценить чувствительность патогена к разным продуцентам
(выделенным микроорганизмам), метод штрихов – действие исследуемого штамма к спектру микроорганизмов – потенциальных фитопатогенов.
Ход работы
При изучении взаимного влияния штаммов на поверхность среды
в чашки Петри высевают суточную культуру одного из изучаемых микроорганизмов. Посев делают широкой полосой по центру чашки и помещают в термостат при 28 °С на 1–2 сут. После того как колонии вырастут и образуемые бактериями вещества диффундируют в толщу
агара, перпендикулярно первичному посеву подсевают параллельными
штрихами тестерные микроорганизмы. Чашки помещают в термостат
при 28 °С на 24 ч. Результаты учитывают по степени развития культуры
и по расстоянию от начала роста вторичного посева до первичного.
Изучаемый микроорганизм заранее высевают сплошным газоном
на поверхность агаровой пластинки в чашки Петри. На поверхность
другой агаровой пластинки высевают второй изучаемый микроорганизм. Стерильным пробочным сверлом вырезают агаровые блоки из
первых чашек с выросшими микроорганизмами и переносят их на поверхность только что засеянной среды. Чашки помещают в термостат
при температуре 28–30 °С на 48 ч. Результаты учитывают по степени
развития культур вокруг блоков.
Антагонистическая способность исследуемых штаммов. Пред-
варительно микромицеты выращивают на агаризованной среде Чапека
следующего состава (г/л дистиллированной воды):
KCl – 0,5;
74
MgSO4×7H2O – 0,5;
K2HPO4 – 1,0;
NaNO3 – 2,0;
FeSO4 – 0,01;
CaCO3 – 3,0;
сахароза или глюкоза – 20,0;
агар-агар – 20,0.
Стерилизация осуществляется при 0,5 атм.
Посев производят газоном, используя суспензию спор в концентрации 1×106 на чашку Петри. В агаре вырезают лунки диаметром 8 мм,
в которые вносят по 0,2 мл культуральной жидкости. Чашки Петри
осторожно устанавливают в холодильник при 10 °С и спустя 10 ч переносят в термостат с температурой 28 °С. Через 5 сут измеряют ширину
колец ингибирования роста, образовавшихся вокруг отверстий [76].
Обработка результатов
Антагонистическую активность А культуральной жидкости азотфиксаторов рассчитывают по формуле [77]
,
где D – диаметр зоны;
d – диаметр лунки;
V – объем культуральной жидкости;
g – масса исследуемого материала.
Контрольные вопросы
1. Какими методами определяют характер взаимного влияния
штаммов?
2. В чем заключается метод определения антагонистической ак-
тивности?
3. Почему в среду Чапека добавляют молочную кислоту?
4. Назовите режим автоклавирования среды Чапека.
5. Поясните следующие термины: культуральная жидкость, ино-
кулят.
6. Как проводится посев газоном?
75
7. Проанализируйте результаты, полученные при определении
антагонистической активности.
Лабораторная работа 8
ОТБОР МИКРООРГАНИЗМОВ-СТИМУЛЯТОРОВ
ПО ИХ ВЛИЯНИЮ НА СЕМЕНА
Цель работы: определить влияние автохтонных штаммов на
морфо- и биометрические показатели корешков и проростков растений.
Оборудование, материалы и реактивы:
– автоклав;
– аквадистиллятор;
– весы аналитические с точностью взвешивания до 0,01 г;
– стерилизатор воздушный;
– термостат;
– шейкер;
– стерильные чашки Петри;
– колбы на 100 мл;
– семена одно- и двудольных тест-растений;
– дистиллированная вода;
– фильтровальная бумага;
– спиртовки;
– спички и др.
Стимулирующее влияние микроорганизмов на растения проявляется с момента прорастания семян. На этом основан метод использования семян в качестве биотеста для обнаружения микробов-стимуляторов в составе ризосферной микрофлоры или в других сообществах.
Семена в силу своей природной разнокачественности неодинаково реагируют на внешние воздействия, в том числе и на обогащенные
продуктами жизнедеятельности микроорганизмов. В связи с этим для
получения объективных результатов в исследованиях с использованием
семян в качестве биотестов лучше всего проводить эксперименты не с
одним, а с несколькими образцами семян. В качестве биотестов используют: зерновые культуры – пшеница Triticum aestivum L. и просо Pani-
cum miliaceum, кормовые – кукуруза Zea mays L., бобовые – горох Pisum
76
sativum L., овощные – огурцы Cucumis sativus, томат Solanum lycopersicum, редис Raphanus sativus, салат Lactuca sativa L. и др. [78, 79].
Для всесторонней оценки влияния продуктов жизнедеятельности
испытуемых микроорганизмов на процесс прорастания семян рекомендуется учитывать ряд принятых в семеноведении показателей: всхожесть, энергию, дружность прорастания [60, 80]. Всхожесть – способность семян образовывать нормально развитые проростки. Стандартами предъявляются следующие требования к нормам всхожести семян: семена первого класса основных зерновых культур должны иметь
этот показатель не ниже 95 %, семена твердой пшеницы – не ниже 90 %.
Число нормально проросших семян выражают в процентах от общего числа семян, взятых для анализа. Этот показатель определяют одновременно со всхожестью, он характеризует дружность прорастания.
Энергия прорастания – способность семян сельскохозяйственных культур к быстрому дружному прорастанию. Определяется одновременно со всхожестью числом проросших семян (в %) в течение определенного для каждой культуры срока. Этот важный показатель посевных качеств семян учитывается обычно за первые трое суток в процентах от общего количества семян, взятых для проращивания [81].
При определении длины корней у двудольных растений измеряют
главный корень, выделяющийся толщиной и длиной среди придаточных и боковых корней. У однодольных растений корневая система состоит из большого количества примерно одинаковых по размерам корней. В этом случае определяют длину наиболее длинного корешка.
Ход работы
Обогащение семян микробными метаболитами осуществляют посредством замачивания в культуральной жидкости испытуемых микроорганизмов, полученных в результате их культивирования в жидкой питательной среде. Продолжительность выращивания составляет 6–8 сут,
за это время происходит накопление продуктов жизнедеятельности
микроорганизмов в средах культивирования.
Для замачивания семян употребляют культуральную жидкость,
разбавленную водопроводной водой. При массовом отборе микробовстимуляторов применяют разведение 1:50. Семена, помещенные в металлические бюксы, заливают испытуемыми жидкостями. Жидкость
должна лишь слегка покрывать семена, чтобы они не задохнулись. Для
сравнения семена из той же партии замачивают в воде и в незасеянной
77
питательной среде, используемой для выращивания испытуемых микроорганизмов, разведенной в 50 раз. Замоченные образцы семян выдерживают 1 ч в термостате при 26–28 °С. В течение этого времени семена
набухают, поглощая вместе с жидкостью содержащиеся в ней продукты
жизнедеятельности микроорганизмов.
Набухшие семена помещают в чашки Петри на смоченную водой
фильтровальную бумагу, увлажненную так, чтобы жидкость полностью
впиталась в фильтр. Чашка Петри вмещает 25 крупных или 50 мелких
семян. В каждом варианте используют строго одинаковое количества
воды. Продолжительность проращивания набухших семян во влажной
камере (чашки Петри) составляет 4 сут.
Результаты учитывают по весу выросших проростков, отделенных от семян. Сырые проростки взвешивают на аналитических весах.
Затем проростки высушивают при 60 °С до постоянной массы. Не все
взятые для проращивания семена могут прорасти (в пределах одной повторности), поэтому для получения сравнительных данных результаты
выражают в г/100 семян. Отдельно устанавливают вес проростков и корешков. Обычно вес корешков является более показательным. Окончательный результат вычисляют как среднее из всех повторностей, которых должно быть не менее трех. Средний вес проростков (или отдельных их частей) выражают не только в граммах, но и в процентах.
При более детальном изучении микроорганизмов как стимуляторов роста растений используют несколько разведений культуральных
жидкостей: 1:50, 1:100, 1:200, 1:500 и т.д. для установления оптимальной концентрации, при которой обнаруживается максимальный стимулирующий эффект. Все последующие эксперименты проводят только с
оптимальной для каждого испытуемого микроорганизма концентрацией культуральной жидкости.
Процедура замачивания семян та же. После замачивания для
определения энергии, дружности и скорости прорастания семена помещают (по 100 штук в каждой повторности) на фильтровальную бумагу,
смоченную водой или питательной смесью. Проращивание продолжают 10 сут. Через каждые сутки в специальном журнале отмечают количество проросших семян (отдельно для каждой повторности). Результаты, полученные для каждой повторности (отдельно для каждого показателя), суммируют и определяют среднее для каждого варианта.
Сравнение средних показателей между собой позволяет определить
степень стимулирующего действия метаболитов испытуемых микроорганизмов на разные стороны процесса прорастания семян.
78
Для инокуляции семян используют 4-суточные культуры, выращенные на средах Эшби и Муромцева. Титр бактериальной суспензии –
2.0×109 – 8.0×109 кл./мл, количество клеток на одно семя – 200–300 тыс.
Инокуляцию растений чистыми культурами и комплексом штаммов проводят в чашках Петри. Семена исследуемых тест-культур стерилизуют с поверхности 70 % этиловым спиртом в течение одной минуты, затем 1 % раствором KMnO4 в течение 20 мин и тщательно промывают стерильной дистиллированной водой. Обработанные таким образом семена раскладывают в чашки Петри на поверхность увлажненной фильтровальной бумаги в количестве 25 штук на чашку.
После двух суток инкубирования в темноте при 26 °С проростки
обрабатывают исследуемыми штаммами и комплексом микроорганизмов. Спустя 2–4 сут инкубирования на свету при 22 °С определяют общую длину проростков (мм) и сухую массу (мг).
Контрольные вопросы
1. В чем состоит суть отбора микроорганизмов-стимуляторов по
их влиянию на семена?
2. Какие растения используют в качестве биотестов?
3. Поясните следующие термины: всхожесть, энергия прораста-
ния, дружность прорастания.
4. Как стерилизуют семена исследуемых тест-культур?
5. Как измеряют длину корней у одно- и двудольных растений?
6. Проанализируйте и интерпретируйте результаты, полученные
в процессе отбора микроорганизмов-стимуляторов.
79
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В Концепции развития аграрной науки и научного обеспечения
агропромышленного комплекса Российской Федерации на период до
2025 года важное значение отводится созданию инновационных биопрепаратов по защите растений, которые позволят сохранить биоразнообразие, стабилизировать фитосанитарную обстановку, сократить уровень потерь урожая и увеличить уровень рентабельности сельскохозяйственного производства.
В настоящее время уровень биологизации в России относительно
невысок. В Татарстане биопрепараты используют в большинстве муниципальных районов, что составляет около 30 % от общего объема защитных мероприятий [82].
Задача современной биотехнологии и микробиологии состоит в
изучении и применении автохтонной микрофлоры как одного из главных компонентов почвы. Исследование состояния почвенного микробоценоза как «живого» потенциала биогенных элементов включает методы определения численности и идентификации агрономически ценных микроорганизмов, их активности и т. д. Новые биоудобрения, созданные на основе консорциумов эффективных автохтонных микроорганизмов, повысят конкурентоспособность агропромышленного комплекса страны.
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]