Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов. Учебно-методическое пособие

Стерилизация при 0,5 атм.

Стерилизация при 1 атм.

Среда Муромцева (г/л):

глюкоза – 10,0;

аспарагин – 1,0;

агар-агар (белый вымороженный) – 20,0;

вода водопроводная.

Использование трехнатриевого фосфата в сухом виде (возможно и без специальной стерилизации, если чистый препарат хранится под слоем спирта) позволяет избежать его гидролиза в растворе. При такой последовательности внесения трехнатриевый фосфат взаимодействует с хлористым кальцием по мере растворения. В среде происходит следу­ющая реакция:

Агаризованную глюкозоаспарагиновую среду с фосфатом Са раз­ливают в чашки Петри по 20 мл, засевают поверхностно из 10-4-10-6 раз­ведений почвенной болтушки и инкубируют при температуре 28 °С в течение 2–10 сут. По образованию зон просветления вокруг колоний ак­тивных микроорганизмов судят об их способности растворять фосфат кальция.

для культивирования микроорганизмов?

тов, назначению и физическому состоянию?

стика и области применения.

Активная кислотность (рН) среды. Имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растет при значении рН, близком к 7,0, микроскопические грибы предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовленных средах всегда следует определять значение рН. Измеряют значение рН элек­трометрическим методом на потенциометре.

образованием большого количества кислот, то тех количеств буферного раствора, которые можно добавлять к средам (не более 5 г фосфатов на 1 л среды), оказывается недостаточно, так как противодействие любого буфера изменению показателя рН ограниченно. В связи с этим для мик­роорганизмов, активно изменяющих кислотность среды, применение буферов неэффективно. При культивировании таких микроорганизмов в среды вводят избыточное количество мела, который нейтрализует об­разующиеся кислоты. Для нейтрализации кислот по ходу развития культуры можно применять 10 % стерильный раствор бикарбоната натрия NaHCО3.

Среди облигатных аэробов выделяют группу микроаэрофильных микроорганизмов, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут, если его парциальное давление меньше, чем в воздухе. Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода. Получение энергии у них не связано с использованием молекулярного кислорода, а для многих кислород даже токсичен: он угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие микроорганизмы называются облигат- ными анаэробами. Факультативные анаэробы (аэробы) способны расти как в присутствии, так и в отсутствие молекулярного кислорода. Неодинаковые потребности микроорганизмов в свободном кислороде учитывают при выборе способа их выращивания.

ее помутнение. Поверхностное культивирование применяется как в ла­бораторных условиях, так и в промышленности.

Все способы глубинного культивирования аэробных микроорга­низмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения пита­тельной среды с кислородом воздуха. Следует иметь в виду, что при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы исполь­зуют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорга­низмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать.

Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на качал­ках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб и пробирок со скоростью от 100 до 200 об./мин и более. Чем больше частота вращения, тем больше соприкосновение среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Увеличить аэрацию среды при работе на одной и той же качалке можно за счет уменьшения объема среды или применения колб с отбойниками – вдавливаниями стекла внутрь в виде 4–8 отростков длиной от 2 до 3 см. При вращении колб с отбойниками поверхность соприкосновения среды с воздухом заметно увеличивается благодаря разбрызгиванию жидкости. Чем больше отбойников, тем сильнее раз­брызгивание жидкости, тем выше аэрация.

Для аэрации культуры микроорганизмов, помимо перемешива­ния, можно применять продувание стерильного воздуха через толщу среды. Этот способ часто используют в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микро­биологии при получении биомассы и различных продуктов жизнедея­тельности микроорганизмов – антибиотиков, ферментов, кислот. Ско­рость потока воздуха через среду необходимо контролировать. Для этого используют различные приборы – газовые часы, ратометры и др. В ферментерах количество пропускаемого воздуха поддерживают на заданном уровне автоматически. Воздух стерилизуют путем пропуска­ния через активированный древесный уголь, стеклянную вату, пропи­танную антисептиком, или специальные ткани из полимеров. В лабора­торных опытах, когда объем и скорость поступления воздуха невелики,

используют заранее простерилизованные ватные фильтры. Для воз­можно более сильного распыления воздух пропускают через мелкопо­ристые пластинки − барботеры; в лабораторных опытах с этой целью применяют стеклянные фильтры. Для аэрации культур микроорганиз­мов, как правило, используют обычный воздух.

Продувание сред кислородом в лабораторных условиях не реко­мендуется, так как чрезмерное насыщение среды кислородом (до 40 мг/л) может привести к угнетению роста микроорганизмов. В ферментерах принудительную аэрацию обычно совмещают с механи­ческим перемешиванием среды мешалками, скорость вращения кото­рых может достигать сотен и даже тысяч оборотов в минуту.

Иногда используют метод культивирования в вязких средах. Диффузия кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязко­сти, поэтому в вязких средах, таких как картофельная или среды с ку­курузной либо другой мукой, хорошо развиваются некоторые облигат­ные анаэробы, например возбудители маслянокислого или ацетонобу­тилового брожения. Вязкость сред легко увеличить добавлением к ним от 0,2 до 0,3 % агара.

Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах – вакуумных металлических камерах, снабженных манометром. Анаэро­статом может служить обычный вакуумный стеклянный эксикатор. Из анаэростата откачивают воздух, а затем, как правило, заполняют его га­зовой смесью, состоящей из азота (90–80 %) и углекислоты (10–20 %), до давления порядка 67–103 Па (1,7 атм). Избыточное давление исклю­чает возможность диффузии кислорода воздуха [49, 65].

Микроорганизмы являются обязательным компонентом любой почвы. Для оценки их роли необходимы сведения о численности, био­массе и физиолого-биохимической активности. Существует два основ­ных, принципиально различных метода количественного учета микро­организмов в исследуемом объекте (табл. 3): прямой подсчет клеток под микроскопом (в счетных камерах, на фиксированных окрашенных маз­ках, на мембранных фильтрах) и путем культивирования на питатель­ных средах (на плотных средах – чашечный метод Коха, на жидких сре­дах – метод предельных разведений или метод титра) [56, 60].