Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов. Учебно-методическое пособие
.pdf
МЕТОДЫ И ТЕХНИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
МИКРООРГАНИЗМОВ
Одним из важнейших приемов микробиологического исследования почв является изолирование отдельных видов микроорганизмов из
естественной среды обитания. Идентификация любых бактерий невозможна без выделения чистой культуры. Это требование в микробиологии связано с тем, что присутствие представителей других родов и семейств во время проведения бактериологических исследований всегда
существенно искажает результаты, вследствие чего исследователь производит неверные заключения.
Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении
определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять,
чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов [49, 61].
Чистыми (аксеничными) называются культуры только одного
вида микроорганизмов, выросшие на плотных или жидких питательных
средах. Выделение в чистые культуры предшествует изучению как морфологии и цикла развития, так и физиологических и биохимических
процессов, осуществляемых микроорганизмами. Подобное изучение в
конечном итоге дает возможность установить их видовую принадлежность [70].
Для выделения чистой культуры существуют разные методы. Так,
чистую культуру методом Коха получают из одной клетки или отдельной колонии накопительной культуры, из которой после ее разведения
делают высев на плотную среду. Каждую образовавшуюся колонию
считают развившейся из одной клетки.
Культура, в которой преобладают представители одной физиологической группы и даже одного вида микроорганизмов, является нако-
пительной. Из нее петлей отделяют колонию и переносят ее в чашку
Петри с чистой питательной средой и осторожно растирают стерильным стеклянным шпателем, после чего этим же шпателем протирают
поверхность следующих 3–4 чашек. Чашки термостатируют до 7 сут.
Высев из накопительной культуры факультативных анаэробов
или факультативных аэробов для получения изолированных колоний
делают методом глубинного посева в пробирки со столбиком стерильного агара. Стерильной петлей берут чистую культуру из колоний, одновременно обжигают края пробирки и иглой делают прокол до дна.
61
Выделение чистой культуры анаэробов по методу Коха возможно
только при ограничении доступа кислорода.
Химический метод заключается в том, что к питательным средам
добавляют химические вещества в определенной концентрации. Действие этих веществ на разные виды микроорганизмов неодинаковое –
одни погибают, другие задерживаются в развитии, третьи не реагируют.
На этом принципе основано применение элективных сред.
Этапы выделения чистой бактериальной культуры на бактериальных чашечных посевах. Вначале в чашки Петри с различными пита-
тельными средами рассевают отобранные из почвенных проб образцы.
Затем выращенные отдельные колонии (культуры) высевают на специально подобранных средах, чтобы по продуктам жизнедеятельности колонии в питательной среде изучать биохимические реакции, протекающие внутри бактериальной клетки и вне ее.
Существуют разные схемы дробного посева в чашки Петри на
агаризованные среды (рис. 13–15). Посевы из нативного материала
чаще всего проводят пастеровской пипеткой, из культур микроорганизмов – бактериологической петлей или иглой в зоне пламени горелки. На
культуральных сосудах (пробирки, чашки Петри, колбы) пишут номер
варианта, дату посева.
Хранение микроорганизмов. При длительном хранении в лабораторных условиях могут измениться отдельные физиолого-биохимические или морфологические особенности микроорганизмов. Чтобы избежать этого, необходимо хранить культуру в жизнеспособном состоянии.
Традиционный метод хранения – пассирование (субкультивиро-
вание), то есть пересев на свежие питательные среды с временными интервалами в зависимости от вида микроорганизма, среды и условий хранения. Одни виды микроорганизмов требуют частых пересевов, другие
можно не пересевать более месяца. В процессе такого хранения нельзя
допускать пересыхания среды. Для этого пробирки с культурами рекомендуют обертывать бумагой или пленкой и хранить в условиях, когда
процессы жизнедеятельности заторможены, например в холодильнике
при температуре от 5до 8 ºС.
Существует ряд других способов хранения культур: под слоем
стерильного вазелинового масла; в ампулах с жидким азотом; в лиофилизированном состоянии, то есть высушенными из замороженного состояния. Спорообразующие бактерии могут храниться годами в стерильной сухой почве или соответствующей среде.
62
Так, для выделения чистой аэробной (кислородозависимой) культуры производят механическое дробление исследуемой пробы. Одну
каплю изучаемого материала растирают по поверхности мясо-пептонного агара (МПА). Тем же шпателем (только без нового материала) производят посев еще на нескольких чашках с таким же МПА. Полученные
образцы с аэробными сообществами можно изучать в свете идентификации на бактерии определенных родов.
Для получения чистых культур (микроорганизмов, дрожжей,
микроскопических грибов) применяют также капельный метод Линднера, микроманипуляторный метод, выращивание из единственной колонии на агаре или желатине, метод влажной камеры Ганзена. Перечисленные методы представляют собой основу для исследователей и являются базисом для большого количества методик, которые позволяют
определять следующие свойства бактерий:
– морфологические (особенности и индивидуальные свойства
строения клеток);
– культуральные (питание, дыхание, условия для роста бактериальной культуры);
– ферментативные (биохимические свойства, связанные со способностью бактериальной культуры расщеплять сахара, белки, разрушать эритроциты);
– антигенные (свойства, связанные с особенностями антигенов
чистой бактериальной культуры).
Методы идентификации различных микроорганизмов разрабатывались микробиологами на протяжении многих лет. В настоящее время
они активно используются не только в микробиологии, но и в медицине,
фармацевтике, в промышленном производстве и т. д.
Лабораторная работа 5
ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ
Цель работы: освоить основные методы выделения чистых культур микроорганизмов.
Оборудование, материалы и реактивы:
– автоклав;
– термостат;
– стерилизатор воздушный;
– весы аналитические с точностью взвешивания до 0,01 г;
63
– аквадистиллятор;
– стерильные чашки Петри;
– колбы мерные на 500 и 1000 мл;
– колбы на 250 и 1000 мл;
– цилиндры мерные;
– пробирки;
– пробки;
– дозатор на 0,1 и 1,0 мл;
– наконечники;
– реактивы для приготовления питательных сред;
– спиртовка;
– шпатель;
– бактериологические петли;
– шпатели Дригальского;
– штативы;
– спички и др.
Выделение чистой культуры включает получение накопительной
культуры, выделение чистой культуры и определение ее чистоты. Для
получения накопительной культуры определенного вида бактерий сначала подбирают элективные условия среды, обеспечивающие их преимущественное развитие. Затем из мест их обитания делают посев на
соответствующую селективную среду.
Ход работы
Техника микробиологического посева при выделении чистой
культуры бактерий состоит в следующем.
Посев в полужидкие и жидкие питательные среды. Его основой является метод предельных разведений. Из 6, 7 и 8-го разведений
делают посев 1 мл почвенной суспензии в пробирки с жидкой питательной средой. Из каждого разведения делают высев 5 параллельных пробирок. После инкубации (3–5 сут) при 26–28 °С отмечают наличие роста микроорганизмов по помутнению, образованию пленки или осадка.
Количество клеток в единице объема определяют, используя таблицу
Мак-Креди [60, 62], разработанную на основании методов вариационной статистики [71]. Отбор эффективных штаммов производят по их
скорости роста на конкретной элективной среде. В последующем периодически пересевают выделенные микроорганизмы для проверки
64
чистоты и поддержания их активного роста на специальные среды. По
совокупности морфологических признаков определяют принадлежность микроорганизмов к роду с помощью определителя Берги [72].
Пробирку с исследуемым материалом и пробирку с питательной
средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне
(пробирка с исследуемым материалом должна быть первой по отношению к работающему). В правую руку берут бактериологическую петлю
(иглу или пипетку) как писчее перо. Пробки от пробирок прижимают
мизинцем к ладонной поверхности правой кисти, в зоне пламени горелки пробирки открывают, края пробирок обжигают. Петлю вертикально прокаливают в пламени горелки. Простерилизованную петлю
(иглу, пипетку) вводят через пламя горелки в пробирку с посевным материалом. Петлю охлаждают, забирают небольшое количество материала, переносят в пробирку со стерильной питательной средой. Материал стряхивают в среду или, слегка погружая в жидкость петлю, растирают посевной материал по стенке пробирки, не касаясь среды держателем, после чего смывают его средой. Края пробирок и пробки
вновь проводят над пламенем горелки, закрывают пробирки пробками,
стерилизуют петлю и ставят ее в штатив или стакан. При посеве материала с помощью пипетки использованную пипетку опускают вниз концом в банку с дезинфицирующим раствором.
Посев на плотную питательную среду. Посевы выполняют раз-
ными способами. Эти способы основаны на том, что микроорганизмы
иммобилизуются на поверхности или в глубине питательной среды.
Посев в пробирку. Материал, забранный петлей, опускают до дна
пробирки со скошенным агаром, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразными движением петли проводят снизу вверх,
слегка касаясь поверхности среды (посев штрихом). При посеве материала уколом (рис. 13) в столбик среды петлей с материалом или иглой
прокалывают вертикально центру пробирки питательную среду, петлю
или иглу вынимают, прожигают (правила работы с пробирками и петлей при посеве в пробирку с плотной средой аналогичны правилам при
посеве на жидкие питательные среды).
Посев в чашки Петри. Чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слегка приподнимают крышку, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, обжигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят посевной материал на поверхность питательной среды, затем растирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологической петли.
65
Рис. 13. Посев уколом
Посев петлей:
1) посев штрихом – посевной материал втирают петлей в поверхность среды, у края чаш избыток снимают, проколов агар; оставшийся
материал растирают параллельными штрихами по поверхности среды;
2) посев петлей на секторы – дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки
к центру так, чтобы штрихи с одного сектора не переходили на другой;
3) дробный посев – бактериологической петлей с посевным материалом несколько раз делают параллельные штрихи в одном секторе
чашки Петри, петлю прожигают в пламени горелки, дают остыть и
часть материала из первого сектора распределяют во втором секторе
аналогичным способом, затем в третьем и четвертом секторах (рис. 14).
Рис. 14. Схемы дробного посева в чашки Петри на агаризованные
среды
66
Посев шпателем. Материал наносят на поверхность среды петлей
или пипеткой, затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают по всей поверхности агара, вращая полуоткрытую
чашку. После посева стеклянный шпатель помещают в дезинфицирующий раствор, металлический – прокаливают в пламени горелки.
Посев газоном. 1,0 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют жидкость по всей поверхности чашки. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.
Пересев из пробирки в пробирку. Берут пробирку в левую руку, в
правую – стерильную пипетку или прокаливают над пламенем горелки
бактериальную петлю (рис. 15). Вынимают пробку, прижимают ее мизинцем правой руки к ладони и держат в руке.
Рис. 15. Пересев микроорганизмов из пробирки в пробирку:
а, е – стерилизация петли; б – стерилизация краев пробирки;
в, г – взятие и посев материала; д – закрывание пробирок пробками
67
Петлю (или пипетку) вводят в пробирку, материал на плотной
среде распределяют зигзагообразно, а в жидкой – вращательными движениями. При пересеве из одной пробирки в другую петлю после введения внутрь охлаждают – прикасаются к культуре, а затем извлекают
из пробирки так, чтобы она не касалась пламени горелки. Если петля
сделана из вольфрамовой или другой медленно охлаждающейся проволоки, сначала нужно коснуться стерильной среды, а затем культуры.
Тонкий слой среды на петле не только охлаждает ее, но и предохраняет
микроорганизмы от гибели.
По окончании посева петлю фламбируют и ставят в штатив,
чашки переворачивают и помещают в термостат.
Пересев на скошенный агар. Пересевы проводят над пламенем го-
релки, чтобы теплый воздух препятствовал осаждению микроорганизмов из окружающего воздуха и отчасти их уничтожал. Берут в правую
руку бактериологическую петлю, с помощью которой осуществляют
пересев (петлю держат как карандаш). Стерилизуют бактериологическую петлю в пламени горелки, прокаливая проволоку докрасна, и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, который будет вводиться в пробирку с культурой микроорганизмов. При
прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся
проволока была раскалена.
Обе пробирки, т. е. ту, из которой производится пересев, и ту, которая подлежит засеву, берут вместе и держат между большим и указательным и средним пальцами левой руки. Причем пробирку со стерильной средой размещают дальше от себя, а с культурой микроорганизмов
ближе к себе. Не выпуская бактериологической петли из правой руки,
мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружные
концы ватных пробок к ладони и вынимают пробки из пробирок. Класть
пробки на стол нельзя.
Слегка обжигают в пламени горелки края открытых пробирок.
Вводят в пробирку с культурой микроорганизмов петлю. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого отбирают небольшое количество микробной массы.
Вынимают петлю и вводят ее в пробирку со стерильной питательной средой, избегая соприкосновения со стенками пробирки. Проводят
петлей от дна вверх зигзагообразную или прямую черту-штрих, слегка
касаясь поверхности агара. Обжигают ватные пробки и края пробирок
68
одновременно в пламени и закрывают обе пробирки. Обжигают петлю
в пламени горелки. Все посевы помещают в термостат для выращивания микроорганизмов при температуре, благоприятной для их роста.
Хранение чистых культур и ассоциаций автохтонных микроорганизмов осуществляют в холодильнике (4–6 °С) на скошенной агаризованной среде, оптимальной для сохранения функциональных свойств
исследуемых микроорганизмов.
Чистота выделенных микроорганизмов периодически (раз в месяц) проверяется микроскопированием с фазовым контрастом и высевом на соответствующую элективную питательную среду.
Условности: 1) бактериальные колонии могут вырасти на питательной среде не из одной клетки, а из группы их, оставшихся неразделенными в почвенной взвеси; 2) колонии актинобактерий и микромицетов вырастают из спор и обрывков мицелия разной величины (дифференцировать колонии, образовавшиеся из спор и из мицелия этих микроорганизмов, невозможно, мицелиальные микроорганизмы учитывают, измеряя длину их мицелия при прямом микроскопировании).
Контрольные вопросы
1. Поясните следующие термины: культивирование, культура,
колонии, посев, пересев, инкубация, чистая культура, накопительная
культура, столбики, косяки, пассирование.
2. Для чего выделяют чистые культуры?
3. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
4. Определение чистоты культуры бактерий.
5. Перечислите этапы выделения чистой бактериальной культуры
на бактериальных чашечных посевах.
6. Как проводят посев на жидкую и плотную питательные среды?
7. В чем состоит особенность посева чистой культуры в пробирку?
8. Перечислите особенности посева шпателем, тампоном, газоном, уколом.
9. Какие существуют способы пересева культур микроорганизмов?
10. Какие свойства бактерий называются морфологическими,
культуральными, ферментативными, антигенными?
11. Перечислите способы хранения культур микроорганизмов.
69
Лабораторная работа 6
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРОГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У ДИАЗОТРОФНЫХ
И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ АЦЕТИЛЕНОВЫМ
МЕТОДОМ [73]
Цель работы: определить активность азотфиксации у агрономи-
чески ценных микроорганизмов.
Оборудование, материалы и реактивы:
– хроматограф газовый;
– автоклав;
– термостат;
– стерилизатор воздушный;
– весы аналитические с точностью взвешивания до 0,01 г;
– рН-метр с погрешностью измерения ±0,1 рН;
– аквадистиллятор;
– камера Горяева;
– пенициллиновые флаконы;
– пробки к ним ватные и резиновые;
– инъекционная игла;
– стерильные чашки Петри;
– колбы мерные на 500 и 1000 мл;
– колбы на 250 и 1000 мл;
– цилиндры мерные;
– пробирки;
– пробки;
– дозатор на 0,1 и 1,0 мл;
– наконечники;
– реактивы для приготовления питательных сред;
– спиртовки;
– шпатели;
– бактериологические петли;
– штативы и др.
Нитрогеназа азотфиксирующих микроорганизмов способна восстанавливать ацетилен С2Н2 до этилена С2Н4. Оба непредельных углеводорода легко идентифицируют с помощью газового хроматографа.
Поскольку процессы восстановления молекулярного азота и ацетилена
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]