Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Биотехнологический потенциал почвенных микроорганизмов. Учебно-методическое пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

06.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 56 / 126 7 8 9 10 11 12 > Следующая >>>

При проведении количественного учета необходимо добиться того, чтобы микроорганизмы в суспензии находились в виде свободноплавающих клеток. Для выполнения этого условия осуществляют три процесса: диспергирование почвенных агрегатов; десорбцию клеток микроорганизмов с почвенных частиц; разделение микроколоний на отдельные составляющие их клетки [65].

Выделение почвенной автохтонной микрофлоры проводят на питательных средах. Для выявления микроорганизмов часто применяют метод предельных разведений (МПР). Методические проблемы, возникающие при использовании классического посева МПР, следующие: значительные различия при разной предварительной подготовке образцов почв; количество колоний микроорганизмов при приготовлении параллельных разведений из навесок почвы уменьшается не пропорционально разбавлению, а в гораздо меньшей степени; невозможность полного учета всех микроорганизмов; значительная разница в учете численности бактерий в воздушно-сухих образцах при подготовке разными методами (в 3–20 и даже в 1000 раз), особенно на оструктуренных почвах; при высыхании почвы клетки микроорганизмов не погибают, а переходят в адсорбированное состояние, поэтому их численность при определении с обычной обработкой снижается; после замораживания почвы в холодильнике при −5 °С численность бактерий резко увеличивается за счет диспрегирования почвы и др.

Методами высева на плотные и жидкие питательные среды учитываются только жизнеспособные клетки микроорганизмов. Если необходимо выделить и учесть как можно более широкий круг микроорганизмов, населяющих данный субстрат, используют метод Коха и при этом подбирают такую по составу среду, на которой способны развиваться микроорганизмы с различными свойствами.

Поскольку не существует универсальных питательных сред и условий выращивания, пригодных для всех видов микроорганизмов, метод высева дает возможность определить наличие на субстрате только тех микроорганизмов, которые способны расти на данных средах и в данных условиях.

Лабораторная работа 3

ВЫДЕЛЕНИЕ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ

ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ИХ ЧИСЛЕННОСТИ

Цель работы: ознакомиться с техникой посева почвенных азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, выделения и определения их численности, с основными правилами розлива питательных сред в чашки Петри и пробирки.

Оборудование, материалы и реактивы:

– автоклав;

– термостат;

– стерилизатор воздушный;

– весы аналитические с точностью взвешивания до 0.01 г;

– рН-метр с погрешностью измерения ±0.1 рН;

– аквадистиллятор;

– стерильные чашки Петри;

– колбы мерные на 500 и 1000 мл;

– колбы на 250 и 1000 мл;

– цилиндры мерные;

– пробирки;

– пробки;

– дозатор на 0.1 и 1.0 мл;

– наконечники;

– реактивы для приготовления питательных сред;

– спиртовки;

– штативы;

– шпатели Дригальского;

– бактериологические петли;

– спички и др.

Сущность метода заключается в посеве определенного количества исследуемого субстрата (почвы, грунта) в чашки Петри с плотной питательной средой, на которой после термостатирования подсчитывают выросшие колонии.

Ход работы

Микробиологический посев осуществляется методом предельных разведений. Метод предельных разведений (рис. 12) позволяет

выявить на различных питательных средах численность различных физиологических групп почвенных микроорганизмов. Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений. Для диспергирования почвенных агрегатов применяют растирание: берут 1 г почвы, увлажняя его небольшим количеством стерильной воды из колбы с 99 мл воды, и растирают в ступке пестиком в течение 5 мин до пастообразного состояния. После растирания в ступку добавляют еще раз небольшой объем воды из колбы, тщательно смывают частицы почвы со стенок ступки и с поверхности пестика и переносят все содержимое обратно в колбу.

Рис. 12. Метод предельных разведений для учета

почвенных микроорганизмов

Затем в течение 10 мин осуществляют встряхивание колбы на шейкере. Для предотвращения повторной сорбции клеток на поверхности почвенных частиц шейкер регулируют так, чтобы он совершал встряхивающие, а не круговые движения [53].

Поскольку численность популяции микроорганизмов обычно достаточно велика, для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений [62, 66]. Разведения

готовят в стерильных водопроводной воде или 0,9 % растворе NaCl, используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, так как это уменьшает вероятность ошибки.

Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9,0 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1.0 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9,0 мл стерильной воды – это первое разведение (10-1). Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3–5 раз, затем этой же пипеткой отбирают 1,0 мл полученной суспензии и переносят во вторую пробирку – получают второе разведение (10-2). Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов. Соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции [67].

Следовательно, посев почвенной суспензии на плотные среды производится из разведении 1:10; 1:100; 1:1000 и далее в зависимости от группы учитываемых микроорганизмов, типа почвы, ее влажности и т. д. Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способами.

Посев на плотную среду в чашки Петри. Вынимают чашки Петри из бумаги, в которой они стерилизовались, и ставят их на ровную горизонтальную поверхность. Для поверхностного посева разливают расплавленную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15–20 мл в каждую, когда она имеет температуру около 45 °С, так как при этом на крышках чашек не образуется капель воды в результате конденсации пара. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушивать для удаления конденсационной воды.

Посев на чашки с агаром производят штрихом с помощью петли либо втиранием стеклянным или металлическим шпателем. При посеве петлей ею захватывают небольшое количество инокулята и легко проводят по поверхности агара, нанося ряд параллельных линий или волнообразную черту (посев штрихом). При посеве шпателем из пробирок с приготовленными разведениями стерильной пипеткой или дозатором со стерильным наконечником наносят на поверхность питательной среды точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) суспензии. Стерильным шпателем Дригальского без нажима плавными круговыми

движениями от центра каплю равномерно распределяют по поверхности среды, постепенно втирая ее в агаровую пластинку. Растирание продолжают до тех пор, пока шпатель не перестанет свободно скользить по поверхности среды и появится легкое трение, что свидетельствует о втирании всего объема жидкости в среду. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. Засеянным таким образом чашкам Петри дают подсохнуть еще в течение 20–30 мин, переворачивают их вверх дном, ставят в термостат при температуре оптимальной для роста микроорганизма. Чашки Петри подписывают. Колонии бактерий подсчитывают обычно через 3–7 сут инкубации в термостате.

При глубинном посеве из нужного разведения пипеткой берут 1,0 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки Петри, равномерно распределяя по поверхности агара круговыми движениями. Затем в каждую чашку вливают предварительно расплавленную и остуженную до 45 °С агаризованную среду в количестве 15–20 мл. Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде, для чего осторожно круговыми движениями перемещают чашку Петри по поверхности стола. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды, после застывания которой подписанные чашки (дата, вариант) в перевернутом виде помещают в термостат при 28–37 °С на определенное время инкубации (на 3–7 сут). После инкубации чашки с засеянными средами вынимают из термостата и подсчитывают в них число колоний, которые отражают число жизнеспособных клеток микроорганизмов в почве.

Подсчет колоний. Число микроорганизмов в почве можно определить прямым подсчетом. Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. Окончательный подсчет делают спустя 7–10 сут, так как есть медленно растущие формы микроорганизмов.

Чтобы установить количество микробных клеток в 1 г сырой почвы, число колоний в чашке Петри умножают на степень разведения. Иногда клеток так много, что развившиеся колонии микроорганизмов сливаются. Это часто наблюдается в чашках при разведении 1:100. При высоких разведениях вырастают единичные колонии (менее 10), которые могут образоваться из случайно попавших из воздуха клеток при внесении в чашку суспензии или питательной среды. Учет в этом случае недостоверен.

Для правильного определения числа клеток подсчитывают только те, количество колоний в которых свыше 10, но не более 250–300 (в последнем случае при условии, что колонии очень мелкие). При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и, чтобы дважды не учесть одни и те же колонии, помечают их чернилами или тушью. Чтобы не пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой.

Иногда в последнем разведении число колоний более 300. Такой посев желательно повторить, увеличив число разведений. Если это невозможно, подсчет проводят с учетом того, что он дает представление лишь о минимальном количестве микроорганизмов в почве. Большое число колонии (более 300) подсчитывают с помощью камеры Вольфюгеля. Перевернутые вверх дном чашки помещают под подставу камеры и накрывают стеклянной пластинкой, на которую нанесена сетка. Стороны образованных ею квадратов могут измеряться в сантиметрах или миллиметрах. Число колоний подсчитывают в разных местах чашки (в 20–25 квадратах) и делают пересчет на общую площадь чашки.

Для сравнения количества бактерий в разных почвах необходимо подсчитать их число на 1 г абсолютно сухой почвы. С этой целью одновременно со взятием навески почвы для приготовления разведений в отдельном бюксе, высушенном до по-стоянной массы, берут навеску (5–10 г), определяют ее влажность, сушат почву при 105 °С до постоянной массы. Для подсчета числа клеток микроорганизмов в 1 г сырой почвы определяют разность между массой сырой и сухой почвы, делят на массу навески и умножают на 100.

Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех разведений. Причем из каждого делают 2–4 параллельных высева. Наиболее точный подсчет получается, если на чашке развивается 50–200 колоний бактерий. При первых анализах трудно предвидеть, сколько микроорганизмов содержится в почве, поэтому делают посев из трех последовательных разведений.

Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 2–15 сут инкубации. Подсчет проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, подсчитывают колонии в каждом из них и суммируют результаты. Результаты учитывают на тех чашках Петри, на которых вырастает от 30–50 до 100–150 колоний. Если число

выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета

=10

количества клеток в исходном материале не используют.

Таким образом, при слишком густом или разреженном посеве подсчет количества микроорганизмов будет очень неточным. Поэтому из каждого образца почвы берут не менее 3–5 повторных навесок и каждую высевают на 3–5 чашек Петри с различными средами.

Обработка результатов

Подсчет выросших колоний проводят, не открывая чашек Петри, согласно требованиям МУ №ФЦ/4022-2004 [68]. Закрытые чашки Петри просматривают в проходящем свете и с внешней стороны водостойким маркером отмечают колонии. Численность микроорганизмов выражают в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г почвы после ее высушивания при температуре 105 °С [66].

Количество КОЕ микроорганизмов в пересчете на 1 г воздушносухой почвы рассчитывают по формуле

где М – количество клеток в 1 мл,

а – среднее число колоний при высеве данного разведения,

10 – коэффициент разведения, n – порядковый номер разведения, из которого сделан высев, V – объем суспензии, взятый для посева, мл.

Контрольные вопросы

1. Методика отбора проб почвы для микробиологического ана-

лиза.

2. Как готовят почву для приготовления суспензии и последую-

щего высева на плотные питательные среды?

3. Условия, необходимые для выращивания микроорганизмов:

температура, аэрация, кислотность среды и др.

4. Перечислите типы микроорганизмов по отношению к кисло-

роду.

5. Какие существуют группы микроорганизмов по отношению к

температуре, каковы их температурные оптимумы?

6. Техника проведения посева на плотные питательные среды ме-

тодом предельных разведений.

7. Перечислите последовательность действий при поверхностном

посеве в чашки Петри.

8. Как проводят подсчет выросших колоний при небольшом и

значительном их количестве?

9. Проанализируйте и интерпретируйте полученные результаты

микробиологического посева.

Лабораторная работа 4

ВЫДЕЛЕНИЕ АССОЦИАТИВНЫХ ДИАЗОТРОФОВ

ИЗ РИЗОСФЕРЫ И РИЗОПЛАНЫ РАСТЕНИЙ

Цель работы: выделить из ризосферы и ризопланы растений ассоциативные диазотрофы и определить их численность.

Оборудование, материалы и реактивы:

– автоклав;

– термостат;

– стерилизатор воздушный;

– весы аналитические с точностью взвешивания до 0,01 г;

– аквадистиллятор;

– эксикатор;

– микроизмельчитель тканей РТ-2;

– фарфоровые чашки;

– стерильные чашки Петри;

– колбы на 1000 мл;

– цилиндры мерные;

– пробки;

– бактериологические петли или иглы;

– реактивы для приготовления питательных сред;

– спиртовки;

– штативы;

–шпатели;

–спички и др.

Сущность метода заключается в определении присутствия в почве азотфиксирующих микроорганизмов методом комочков обраста-

ния. Принимая во внимание комплекс положительных свойств азото-

Степень обогащенности почв

Азотобактер, %

Очень низкая

<10

Низкая

10-25

Средняя

26-50

Высокая

51-70

Очень высокая

71-100

бактера как свободноживущего азотфиксатора, проведены исследования по обнаружению данного вида в почвенных образцах различных биоценозов. На основании полученных данных разработана шкала оценки биогенности серых лесных почв по населенности азотобактером (табл. 4).

Таблица 4

Шкала биогенности серых лесных почв

по населенности азотобактером [69]

Ход работы

Корни растений размачивают с оставшейся на них почвой в воде. Затем в колбах с физиологическим раствором (по 100 мл) проводят двукратную мягкую отмывку корней ручным встряхиванием в течение 5 мин, а в дальнейшем – двукратную обработку корней с помощью микроизмельчителя тканей при 5 тыс об./мин в течение 5 мин в 100 мл физиологического раствора (жесткая отмывка).

Приготовленный материал проверяют на присутствие диазотрофов путем раскладывания фрагментов корней на агаризованную среду Эшби и полужидкую малатную среду Доберейнер.

Присутствие в изучаемой почве азотобактера проводят следующим образом. Навеску почвы в 10–20 г увлажняют стерильной водой в фарфоровой чашечке до состояния густой пасты и раскладывают микробиологической петлей (иглой) или шпателем правильными рядами в виде 25–50 комочков по 0,05 или 0,1 г (размером примерно со спичечную головку) на 2–3 чашки Петри с заранее разлитой застывшей средой Эшби и подкисленной до рН 4,0. Для удобства под чашку подкладывают трафарет с точками. При работе с нейтральными почвами лучше использовать стрептомицин (80 мг/л).

Среду наливают в чашки толстым слоем, чтобы она дольше не

вM=%100

пересыхала. Для каждого образца почвы используют две чашки Петри, которые помещают во влажную камеру (эксикатор) и инкубируют в термостате 5–7 сут.

Учет проводят по числу комочков со слизистыми обрастаниями и выражают результаты в процентах. Поскольку комочки почвы могут обрастать и бактериями, дающими на этой среде слизистый рост, то учет необходимо проводить с микроскопическим контролем.

Обработка результатов

где М – количество азотобактера, %;

а – число разложенных почвенных комочков; в – число слизистых почвенных комочков.

Контрольные вопросы

1. Приведите формулировки ризосферы и ризопланы.

2. Что представляет собой жесткая отмывка корней?

3. Почему присутствие азотобактера в почвах является положи-

тельным фактором?

4. В чем достоинства и недостатки метода комочков обрастания?

5. Какая среда является предпочтительной для выявления азото-

бактера в почвах?

6. Какой процент присутствия представителей рода Azotobacter в

серых лесных почвах относится к высокой степени обогащенности?

7. Проанализируйте и интерпретируйте результаты, полученные

при использовании теста на присутствие азотобактера в почве.

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 56 / 126 7 8 9 10 11 12 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]