Практикум по биохимии. Ч.I. Физико-химические методы. Учебное пособие

реннего объема гранул Kav, которая не зависит от размеров колонки, но зависит от типа геля и размера молекул:

где Ve – объем элюирования (выхода с колонки) данного вещества. Используя Ve и ширину пика ω (см. рис. 4.5), можно также по

уравнению (10) рассчитать число эквивалентных теоретических тарелок. Затем по формуле (11) можно определить величину ВЭТТ, оценивающую эффективность гель-фильтрации на конкретной колонке.

4.11.Практические советы к работам Х-1, Х-2 и Х-3

1.Рекомендуется выполнить все три работы за одно практическое занятие.

2.Приступать к выполнению этих работ следует только с чистыми руками.

3.Старайтесь не касаться пальцами того участка бумаги или пластинки, где будет происходить процесс хроматографирования.

4.Используйте для разметки листа бумаги или пластинки только простые карандаши (а не ручки), а также чистые линейки и ножницы.

5.Для идентификации компонентов смеси используют метод хроматографии со свидетелями – чистыми веществами, предположительно входящими в состав разделяемой смеси. Растворы свидетелей наносят на тот же лист бумаги или пластинку, что и смесь, и хроматографируют их совместно, в одинаковых условиях.

6.Хроматография должна происходить в герметичной камере

при полной насыщенности атмосферы парами растворителя. В противном случае может иметь место так называемый эффект фитиля – растворитель с постоянной скоростью всасывается сорбентом, но фронт после достижения некоторого положения замедляет свое движение, так как происходит интенсивное испарение растворителя в атмосферу. При этом не только замедляется процесс разделения, но оно еще и ухудшается из-за подтягивания пятен к фронту.

81

Х-1. Разделение смеси аминокислот методом хроматографии на бумаге

Приборы и реактивы:

1)хроматографическая камера;

2)хроматографическая бумага FN-3, листы 550 х 150 мм;

3)капилляры для нанесения растворов веществ;

4)простые карандаши, линейка, ножницы;

5)система растворителей: четыре объема н-бутилового спирта, один объем уксусной кислоты (ледяной) и пять объемов воды. Смесь тщательно встряхивают, выдерживают не менее 48 ч, затем отделяют и используют верхний органический слой;

6)проявитель – 0,2 %-й раствор нингидрина в этаноле;

7)исследуемый раствор смеси аминокислот. Концентрация каждой аминокислоты 1 %;

8)водные 1 %-е растворы свидетелей: глицина, аланина, валина, аспарагиновой кислоты.

Смесь нескольких аминокислот может быть разделена при помощи одномерной хроматографии на бумаге. Разделение происходит вследствие различия у разных аминокислот коэффициентов распределения между водной фазой, неподвижно закрепленной в порах бумаги, и подвижной фазой какого-либо органического растворителя. Глицин, аланин и валин относятся к группе алифатических аминокислот, а аспарагиновая кислота – к группе кислых аминокислот.

Как видно из таблицы, в ряду глицин – аланин – валин происходит увеличение размера углеводородного радикала, что повышает их гидрофобность, а значит, их растворимость в подвижной органи-

ческой фазе, что вызывает увеличение .

Из уравнения скорости движения хроматографической зоны (9) следует, что в этом ряду будет увеличиваться и скорость движения вещества при хроматографии, т. е. возрастать величина Rf (12). Это и наблюдается в действительности. Увеличение длины гидрофобного радикала в аминокислотах приводит к увеличению их Rf.

Наличие же полярных групп (–NH2, –COOH и др.) снижает величину Rf, так как увеличивается растворимость в неподвижной водной фазе. Так, аспарагиновая кислота, отличающаяся от аланина

82

только присутствием карбоксильной группы, имеет значительно меньшую величину Rf.

Скорость движения и степень разделения аминокислот зависят не только от их строения, но и от свойств применяемой подвижной органической фазы, в качестве которой чаще всего используют фенолы, спирты, кетоны. С увеличением полярности подвижной фазы возрастает подвижность веществ при хроматографии. При разделении аминокислот используют верхний органический слой системы н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5), в котором содержатся наряду с бутанолом равновесные количества воды и бутилацетата.

Для обнаружения пятен аминокислот на хроматограмме применяют цветную реакцию на аминогруппу с нингидрином. Аналогичное окрашивание дают не только аминокислоты, но и восстановители и аммиак, а также пептиды, белки, первичные алифатические

83

амины, аминосахара и производные аминокислот. Реакция с нингидрином быстрее протекает при повышении температуры.

Экспериментальная часть

Лист бумаги 550 х 150 мм размечают, как показано на рис. 4.6 (линию фронта отмечать не надо). Места нанесения веществ на линии старта отмечают и подписывают карандашом.

Рис. 4.6

Исследуемый раствор и растворы свидетелей тремя касаниями наносят на линию старта при помощи капилляров в виде пятен диаметром не более 7 мм. Оптимальное количество отдельной амино-

кислоты в смеси составляет 1 5 мг. Пятна высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Сгибают лист по линиям сгиба и заправляют его в лодочку, в которую затем наливают систему растворителей, используемую в качестве подвижной фазы. Лодочка должна быть наполнена на 3/4 объема. На дно камеры наливают слой системы, используемой для разделения, в целях создания насыщенной атмосферы. Камера должна быть герметичной. Хроматография длится 12 18 ч, поэтому последующие процедуры лучше перенести на другой день.

Хроматограмму осторожно вынимают из лодочки (так, чтобы на нее не пролился растворитель) и высушивают на воздухе. Затем об-

84

рабатывают хроматограмму раствором нингидрина в этаноле для обнаружения пятен. Бумага должна быть основательно пропитана проявляющим раствором, однако не настолько, чтобы произошло размывание пятен.

Затем хроматограмму высушивают на воздухе (или в сушиль-

ном шкафу при 50 60 °С в течение 15 20 мин). Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. В отчете нужно указать, какие аминокислоты присутствовали в исследуемой смеси, отметить цвет и интенсивность окраски пятен после реакции с нингидрином, а также рассчитать значения Rf по уравнению (13) для каждого пятна.

Х-2. Разделение смеси аденозин-5'-монофосфата (АМP), аденозин-5'-дифосфата (АDP) и аденозин-5'-трифосфата (АТP) методом хроматографии на DEAE-бумаге

Приборы и реактивы:

1)камера для хроматографии;

2)DEAE-бумага DЕ-81, 140 х 70 мм;

3)капилляры для нанесения растворов веществ;

4)линейка и карандаш;

5)ультрахемископ;

6)3 %-е водные растворы натриевых солей АМP, АDP и АТP;

7)буферный раствор: 4 М муравьиная кислота – 0,1 M формиат аммония, рН 1,8.

Для разделения способных к ионизации соединений (например, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, аминокислот и т. п.) широко используется ионообменная хроматография. Обычно применяют хроматографию на колонке, но для анализа и идентификации микроколичеств веществ можно использовать также бумагу, изготовленную из порошка ионита. При этом механизм разделения веществ будет тот же, что и при хроматографии на колонке, но по внешнему оформлению процесс больше похож на хроматографию на бумаге.

В качестве подвижной фазы применяют различные буферные растворы. Движение подвижной фазы осуществляется за счет сил капиллярного смачивания.

85

В качестве анионообменника широко используют DEАE-целлюлозу, которая представляет собой природный полимер (целлюлозу) с введенными в него диэтиламиноэтильными (DEАE) группами. Схематично ее можно изобразить следующим образом:

Волнистой линией здесь изображена нерастворимая целлюлозная матрица, Et – этильная группа, а (А–) – противоионы, способные обмениваться на другие анионы, находящиеся в разделяемой смеси.

Емкость ионообменника зависит от рН раствора, так как в зависимости от рН изменяется количество заряженных групп на поверхности сорбента. Для DEАE-целлюлозы при рН < 10 емкость колеблется в зависимости от сорта в диапазоне 0,4–1,0 мг-моль/г. Верхний предел рН обусловлен величиной рК аминогрупп DEАE-целлюлозы (рКа 10) (подумайте, насколько изменится емкость DEАE-целлюлозы при рН 10 и рН 11 по сравнению с рН 7).

Разделение смеси АМP, АDP и АТP при хроматографии на DEАE-бумаге в системе 4 М муравьиная кислота – 0,1 M формиат аммония (рН 1,8) осуществляется вследствие различия у данных веществ коэффициентов распределения за счет разной величины их отрицательного заряда.

При кислых значениях рН соотношение отрицательных зарядов у АМP, АDP и АТP будет соответственно 1:2:3, а не 2:3:4, как было бы в нейтральной (или щелочной) среде. Это связано с тем, что в кислой среде концевой фосфат не полностью ионизован. Поэтому применение в качестве подвижной фазы кислого буферного раство-

86

ра существенно улучшает разделение этих соединений. Формулы этих веществ при рН 1,8 выглядят следующим образом:

рис. 4.7. Места нанесения веществ на линии старта отмечают и подписывают карандашом (линию фронта не отмечают).

15 125

Смесь *

АMP *

АDP *

Рис. 4.7

На линию старта наносят пятью касаниями 3 %-е водные растворы исследуемой смеси, а также АМP АDP и АТP в качестве свидетелей. Пятна высушивают в токе воздуха. На дно хроматографиче-

ской камеры наливают 20 мл буферного раствора. Бумагу закреп-

87

ляют на стеклянной палочке и опускают ее в камеру так, чтобы нижняя часть ее была погружена в растворитель на 0,5 см.

ВНИМАНИЕ! Линия старта должна находиться примерно на 1 см выше уровня растворителя.

Через 20 30 мин хроматограмму осторожно (DEАE-бумага очень непрочная) вынимают и высушивают. Обнаружение пятен проводят, рассматривая хроматограмму в УФ-свете на ультрахемископе. Пятна обводят карандашом, отмечают линию фронта растворителя. Затем рассчитывают Rf по формуле (13). По результатам работы оформляют отчет.

Х-3. Разделение смеси нуклеозидов методом тонкослойной хроматографии на силикагеле

Приборы и реактивы:

1)камера для хроматографии;

2)листы силуфола УФ-254 150 x 50 мм;

3)ультрахемископ;

4)капилляры для нанесения растворов веществ;

5)система растворителей: хлороформ – метанол – вода (4:4:1);

6)1 %-й водный раствор смеси нуклеозидов;

7)1 %-е водные растворы уридина, тимидина, цитидина, аденозина.

Работа посвящена разделению методом ТСХ на силикагеле смеси четырех нуклеозидов (аденозин, цитидин, уридин и тимидин) и их идентификации путем сравнения со свидетелями.

Различия в строении этих нуклеозидов приводят к различной адсорбции их поверхностью силикагеля и, следовательно, к различной скорости движения при хроматографии. В порядке увеличения ско-

88

рости движения (увеличения Rf) эти вещества располагаются в следующем ряду:

С< А << U < T.

Вэтом же ряду уменьшается полярность молекул.

Значительное отставание С и А от других нуклеозидов объясняется наличием у них полярных аминогрупп, обладающих высокой адсорбционной способностью. Отставание С от А происходит из-за большей основности цитидина, что обеспечивает большую степень его протонирования по сравнению с А, а это, в свою очередь, повышает полярность цитидина.

Большая скорость движения Т по сравнению с U объясняется, по-видимому, отсутствием у тимидина полярной 2'-окси-группы, а также наличием гидрофобной 5-метильной группы.

Экспериментальная часть

Размечают пластинку в соответствии с рис. 4.8 (расстояния даны в миллиметрах). Места нанесения веществ на линии старта отмечают и подписывают карандашом (линию фронта не отмечают).

Рис. 4.8

При помощи капилляров наносят тремя касаниями 1 %-е растворы веществ. Диаметр пятен ~ 2 мм. В камеру наливают систему растворителей, смачивая при этом бумажную обкладку стенок, осторожно помещают туда пластинку и плотно закрывают камеру. Глу-

89

бина погружения пластинки в растворитель ~ 5 мм, а уровень жидкости не касается линии старта.

После окончания хроматографии (пробег растворителя 100 120 мм) вынимают пластинку и высушивают ее на воздухе. По поглощению в УФ-свете на ультрахемископе обнаруживают пятна веществ, обводят их карандашом и отмечают линию фронта растворителя. Затем рассчитывают Rf каждого пятна по формуле (13). Для отчета представляют хроматограмму и указывают, какие нуклеозиды присутствовали в исследуемой смеси.

Х-4. Разделение смеси декстрана голубого, цитохрома С и хромата калия гель-хроматографией

Приборы и реактивы:

1)коллектор фракций;

2)фотоэлектроколориметр (ФЭК);

3)колонка с сефадексом G-75;

4)пипетка на 1 мл;

5)пробирки;

6)элюент (водный раствор NaСl, 9 г/л);

7)водные растворы: а) голубого декстрана 2000 (3,3 мг/мл); б) цитохрома С (2,5 мг/мл); в) хромата калия (5 мг/мл), содер-

жащие NaСl (18 г/л).

Сефадекс представляет собой гранулированный декстрановый гель, причем номер 75 характеризует пористость геля (75 мл воды связывает 10 г сухого геля). Декстраном называется высокомолекулярный полисахарид, построенный из остатков глюкозы, содержащий α-(1→6)-, а в точках разветвления – α-(1→3)-гликозидные связи. Используемая в работе разделяемая смесь содержит голубой декстран, сравнимый по размеру молекул с сефадексом. Это приводит к тому, что декстран не способен проникать внутрь гранул геля.

Экспериментальная часть

Перед выполнением практической части работы необходимо ознакомиться с работой коллектора фракций и ФЭК. Проверить вертикальность крепления колонки.

90