Практикум по биохимии. Ч.I. Физико-химические методы. Учебное пособие
.pdfМИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Факультет естественных наук Кафедра молекулярной биологии и биотехнологии
Б. П. Челобанов, Д. С. Новопашина, Л. М. Халимская
ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ
Часть I Физико-химические методы
Издание второе, дополненное и переработанное
Учебное пособие
Новосибирск
2019
УДК 577.1 ББК У072я73-5
Ч 390
Рецензент проф. С. Д. Мызина
Одобрено методическим советом факультета естественных наук Новосибирского государственного университета.
Челобанов, Б. П.
Ч 390 Практикум по биохимии : учеб. пособие : в 2 ч. / Б. П. Челобанов, Д. С. Новопашина, Л. М. Халимская ; Новосиб. гос. ун-т. – 2-е изд., доп., перераб. – Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2019. – Ч. I. Физико-химические методы. – 106 с.
ISBN 978-5-4437-0920-8 (Ч. I)
ISBN 978-5-4437-0921-5
Учебное пособие предназначено для студентов 3-го курса факультета естественных наук (специальность 06.03.01 «Биология») и Института медицины и психологии В. Зельмана (специальность 31.05.01 «Лечебное дело») Новосибирского национального исследовательского государственного университета. Пособие включает в себя I часть практикума по биохимии.
|
УДК 577.1 |
|
ББК У072я73-5 |
|
© Новосибирский государственный |
|
университет, 2019 |
ISBN 978-5-4437-0920-8 (Ч. I) |
© Б. П. Челобанов, Д. С. Новопашина, |
ISBN 978-5-4437-0921-5 |
Л. М. Халимская, 2019 |
ОГЛАВЛЕНИЕ |
|
Предисловие .......................................................................................... |
6 |
Глава 1. Спектрофотометрия............................................................. |
7 |
1.1. Область приложений метода...................................................... |
7 |
1.2. Понятие об электронных спектрах поглощения ...................... |
7 |
1.3. Устройство спектрофотометра ................................................ |
11 |
1.4. Закон Бугера – Ламберта – Бера. Оптическая плотность ...... |
13 |
1.5. Учет поглощения растворителем. Разностный метод |
|
измерений.......................................................................................... |
15 |
1.6. Электронные спектры смеси частиц. Изобестическая точка. |
|
Выбор характеристической длины волны ..................................... |
16 |
1.7. Определение степени диссоциации слабой кислоты по |
|
спектрофотометрическим данным.................................................. |
18 |
1.8. Определение константы диссоциации слабой кислоты ........ |
20 |
С-1. Определение константы ионизации цитидина |
|
спектрофотометрическим методом ................................................ |
22 |
Глава 2. Потенциометрия ................................................................. |
30 |
2.1. Область приложений метода.................................................... |
30 |
2.2. Возникновение электродного потенциала. Уравнение |
|
Нернста.............................................................................................. |
30 |
2.3. Уравнение Нернста для гальванического элемента............... |
31 |
2.4. Стандартные электродные потенциалы .................................. |
32 |
2.5. Электроды, применяемые при измерении рН растворов ...... |
33 |
2.6. Определение констант ионизации кислот и оснований |
|
потенциометрическим методом...................................................... |
36 |
П-1. Определение константы ионизации слабого однокислотного |
|
основания методом потенциометрического титрования.............. |
42 |
П-2. Определение константы ионизации слабой одноосновной |
|
кислоты методом потенциометрического титрования ее соли |
|
сильной кислотой ............................................................................. |
43 |
3
П-3. Изучение протолитического равновесия глицина ................ |
44 |
Глава 3. Кинетика .............................................................................. |
49 |
3.1. Основные понятия кинетики.................................................... |
49 |
3.2. Кинетика необратимых реакций первого порядка................. |
52 |
3.3. Кинетика ферментативных реакций........................................ |
53 |
К-1. Кинетика гидролиза сахарозы................................................. |
57 |
К-2. Кинетика гидролиза п-нитрофенилфосфата щелочной |
|
фосфатазой........................................................................................ |
61 |
К-3. Определение кинетических параметров α-амилазы.............. |
64 |
Глава 4. Хроматография................................................................... |
68 |
4.1. Область приложений................................................................. |
68 |
4.2. Коэффициент распределения ................................................... |
68 |
4.3. Основное уравнение равновесной хроматографии................ |
69 |
4.4. Хроматограмма.......................................................................... |
73 |
4.5. Виды и приемы хроматографии............................................... |
74 |
4.6. Хроматография на колонках .................................................... |
75 |
4.7. Бумажная хроматография......................................................... |
77 |
4.8. Тонкослойная хроматография (ТСХ) ...................................... |
77 |
4.9. Ионообменная хроматография................................................. |
79 |
4.10. Гель-хроматография................................................................ |
79 |
4.11. Практические советы к работам Х-1, Х-2 и Х-3................... |
81 |
Х-1. Разделение смеси аминокислот методом хроматографии на |
|
бумаге................................................................................................ |
82 |
Х-2. Разделение смеси аденозин-5'-монофосфата (АМP), |
|
аденозин-5'-дифосфата (АDP) и аденозин-5'-трифосфата (АТP) |
|
методом хроматографии на DEAE-бумаге .................................... |
85 |
Х-3. Разделение смеси нуклеозидов методом тонкослойной |
|
хроматографии на силикагеле......................................................... |
88 |
4
Х-4. Разделение смеси декстрана голубого, цитохрома С |
|
и хромата калия гель-хроматографией........................................... |
90 |
Глава 5. Электрофорез....................................................................... |
93 |
5.1. Краткое описание метода ......................................................... |
93 |
5.2. Поведение нуклеиновых кислот при гель-электрофорезе..... |
95 |
5.3. Лидирующие красители............................................................ |
98 |
5.4. Визуализация нуклеиновых кислот в геле.............................. |
98 |
Э-1. Гель-электрофорез ДНК ........................................................ |
101 |
Список литературы.......................................................................... |
105 |
5
Предисловие
Практикум по биохимии на 3-м курсе состоит из двух частей: физико-химические методы и аналитическая биохимия. Первая часть содержит практические биохимические задачи, которые решаются с использованием законов физической химии и кинетики. Задачи были впервые поставлены В. К. Райтом, В. И. Ямковым, В. С. Богачевым, Н. М. Тепловой и Л. М. Халимской. Основой подготовленного издания послужило разработанное на кафедре молекулярной биологии и биотехнологии методическое пособие: Ямковой В. И., Халимская Л. М., Челобанов Б. П. Практикум по биохимии. Новосибирск : НГУ, 2006. Ч. I. Физико-химические методы.
6
Глава 1. Спектрофотометрия
1.1. Область приложений метода
Спектрофотометрия – метод исследования и анализа веществ, основанный на измерении спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения. К оптической области относятся ультрафиолетовое, видимое и инфракрасное излучения. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии, – зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины волны. Измерения проводятся на спектрофотометре.
Спектрофотометрия широко используется для качественного и количественного анализа аминокислот, белков, коферментов, НАДФ, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и других соединений. Исследование ферментативных реакций также связано с измерением оптического поглощения. С помощью спектрофотометрии можно также проводить турбидиметрический анализ, т. е. измерение света, прошедшего через суспензии, эмульсии и коллоидные растворы. При этом свет не поглощается, а преимущественно рассеивается, но уменьшение интенсивности света может быть определено на спектрофотометре. Поэтому этот метод может быть также использован при анализе клеточных культур, жировых эмульсий, мицелл и других полимерных структур.
1.2.Понятие об электронных спектрах поглощения
В1672 г. Исаак Ньютон установил, что «окрашенные» лучи красного, оранжевого, желтого, зеленого, голубого, синего и фиолетового цветов, выходящие из стеклянной призмы при ее освещении солнечным светом, являются основными элементами белого света. Роль призмы сводится только к расщеплению смеси этих «индивидуальных» лучей. Таким образом, возникло представление о спектре белого света.
В1800 г. Уильям Гершель установил, что термометр, помещенный за красным (длинноволновым) концом спектра, показывает увеличение температуры. Невидимые лучи, располагающиеся за красным концом спектра и несущие тепловую энергию, названы тепловыми или инфракрасными лучами.
7
В 1831 г. Иоганн Риттер при помощи метода почернения фотопластинок открыл невидимые ультрафиолетовые лучи, входящие в ультрафиолетовую часть спектра, расположенную за фиолетовым концом видимой части спектра. Эти наблюдения положили начало исследованиям по поглощению света веществом (абсорбционная спектроскопия).
Поглощение света сильно зависит как от природы вещества, так и от длины волны. Зависимость поглощения от длины волны λ излучения называется спектром поглощения. Области (выраженные в единицах длины волны) интенсивного поглощения называются полосами или линиями поглощения.
Различают следующие спектральные области электромагнитного излучения:
гамма-излучение: |
λ ≤ 5 пм; |
|
рентгеновское излучение: |
λ = 5 пм – 10 нм; |
|
ультрафиолетовое излучение: |
λ = 10 – 380 нм; |
|
видимое излучение: |
λ = 380 |
– 750 нм; |
инфракрасное излучение: |
λ = 750 |
нм – 2 мм; |
радиоволны: |
λ = 100 мкм – 10 км. |
|
Терагерцевое и микроволновое излучения (сверхвысокочастотное излучение, СВЧ-излучение) являются частью диапазона ультракоротких радиоволн:
терагерцевое излучение: |
λ = 100 мкм – 1 мм; |
микроволновое излучение: |
λ = 1 мм – 1 м. |
Между диапазонами электромагнитного излучения нет резких переходов, они иногда перекрываются, а границы между ними условны.
При помощи спектрофотометра можно измерить поглощение только электромагнитного излучения, относящегося к оптическому диапазону (ультрафиолетовое, видимое и инфракрасное излучение).
Видимое излучение – электромагнитные волны, воспринимаемые человеческим глазом. При разложении луча белого цвета в призме образуется спектр, в котором излучения разных длин волн преломляются под разными углами. Цвета, входящие в спектр, т. е. такие цвета, которые могут быть получены с помощью света одной длины волны (точнее, с очень узким диапазоном длин волн), называются спектральными цветами.
8
|
|
|
|
Фиолетовый |
|
λ = 380–450 нм |
|
|
|
|
|
Синий |
|
λ = 450–480 нм |
|
|
|
|
|
Голубой |
|
λ = 480–510 нм |
|
|
|
|
|
Зеленый |
|
λ = 510–570 нм |
|
|
|
|
|
Желтый |
|
λ = 570–590 нм |
|
|
|
|
|
Оранжевый |
|
λ = 590–630 нм |
|
|
|
|
|
Красный |
|
λ = 630–780 нм |
|
|
|
|
|
Следует понимать, что указанные в таблице границы диапазонов носят условный характер, в действительности же цвета плавно переходят друг в друга.
Поглощение света связано с переходом молекулы из основного состояния в возбужденное:
.
Согласно квантовой механике, такие переходы осуществляются скачкообразно, причем величина поглощенного кванта hυ равна разности энергий возбужденного и основного состояний молекулы
|
возб. |
осн., |
(1) |
где h – постоянная Планка; υ |
С – частота; λ – длина волны, с – |
||
скорость света в вакууме. |
|
|
|
9
Поглощение кванта света с высокой частотой (энергии перехода 10–100 ккал/моль) вызывает в молекуле электронные переходы. Соответствующие спектры в видимой и ультрафиолетовой области называются электронными.
Инфракрасные спектры отвечают колебательно-вращательным переходам (энергии перехода 0,1–10 ккал/моль).
Микроволновые спектры отвечают низшим энергетическим молекулярным переходам – вращательным (энергии перехода
0,01–0,1 ккал/моль).
Излучение еще большей длины волны (более 1 м) уже не вызывает внутримолекулярных переходов; поглощение энергии в этом диапазоне связано с движением молекул и молекулярных систем.
На электронные спектры частиц в растворах сильно влияют
межмолекулярные взаимодействия |
|
|
|
|||
частицы с растворителем, что ведет |
|
|
|
|||
к уширению полос и их смещению. |
Поглощение |
|
|
|||
Полосы поглощения характеризуются |
|
|
||||
значением λmax – это длина волны, |
|
|
||||
отвечающая |
максимальному |
погло- |
|
|
||
щению для |
данной |
полосы. На |
|
|
||
|
|
|
||||
рис. 1.1. в качестве примера показан |
|
|
|
|||
спектр поглощения дифенила (С6Н5)2 |
|
max |
||||
в области |
215–300 |
нм. |
Здесь |
|
Рис. 1.1 |
|
λmax = 252 нм. |
|
|
|
|
|
|
В настоящее время известно, что все молекулы способны поглощать кванты с энергией 50–200 ккал/моль. Это ведет к электронным переходам и даже отрыву электрона или разрыву связей в молекуле. Однако далеко не все молекулы могут поглощать в видимой и тем более в ультрафиолетовой областях спектра. Для того чтобы молекула могла поглощать в этой области, надо облегчить электронные
переходы. Уменьшение энергии кванта |
Е ведет к сдвигу полосы |
||
поглощения в длинноволновую область, поскольку |
|||
∆ |
|
. |
(2) |
|
|||
Уменьшению энергии электронных переходов способствует наличие в молекуле цепи сопряженных связей –С=С–С=С–, ароматических колец и хромофорных групп, например: нитрогруппы
10