Практикум по биохимии. Ч.I. Физико-химические методы. Учебное пособие

Э-1. Гель-электрофорез ДНК

Приборы и реактивы:

1)камера для электрофореза фирмы BioRad (США);

2)УФ-прозрачная гелевая рамка для заливки геля и проведения электрофореза;

3)заливочный столик с резьбовым зажимом;

4)гребенка толщиной 1 мм на 8 карманов;

5)источник постоянного тока фирмы BioRad (США);

6)система гель-документации BioRad (США);

7)автоматические пипетки и носики для них;

8)пробирки типа «Эппендорф»;

9)агароза фирмы Кох-Лайт (Англия);

10)ДНК фага лямбда (концентрация – примерно 500 мкг/мл);

в 50 %-м глицерине; 14) буфер для электрофореза (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА,

рН 8,0).

Бактериофаг – вирус, содержащий двуцепочечную ДНК размером около 50 тыс. пар оснований. В зрелых вирусных частицах это линейная двуцепочечная ДНК с одноцепочечными комплементарными (липкими) концами длиной по 12 нуклеотидов.

Проникая в бактерию-хозяина, липкие концы слипаются, ДНК замыкается в кольцо и транскрибируется как кольцевая молекула. Кольцевая молекула состоит из 48 502 пар оснований. При лизогенном развитии ДНК фага встраивается в ДНК бактериихозяина и далее реплицируется, и передается клеткам-потомкам как обычный хромосомный ген. На этом основано широкое ис-

пользование ДНК фага в генной инженерии в качестве векторной молекулы.

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) – это ферменты, узнающие определенные последовательности (сайты рестрикции)

101

в двуцепочечной ДНК и расщепляющие молекулу ДНК в этих сайтах. Рестриктаза HindIII узнает последовательность

и расщепляет ДНК с образованием липких концов.

На ДНК фага обнаружено семь сайтов для рестрикции HindIII (23 130, 25 157, 27 479, 36 895, 37 459, 37 584 и 44 141 н. п.).

Цель предлагаемой работы – провести электрофорез ДНК фага λ и маркера молекулярных весов ДНК лямбда / HindIII в агарозном геле и сравнить результат с предполагаемой картиной флуоресценции в геле.

Экспериментальная часть

Приготовление 1 %-го агарозного геля: 0,5 г агарозы поместить в коническую колбу, добавить 50 мл буферного раствора для электрофореза и довести до кипения в микроволновой печи (~ 1 мин). Убедиться, что расплавленная агароза представляет собой однородную массу, в противном случае повторить кипячение. Остудить раствор до 50–60 ºС.

Гелевую рамку поместить на заливочный столик и зажать при помощи резьбовых зажимов. Предварительно проверить горизонтальность столика по уровню. Аккуратно вылить в форму горячий раствор агарозы и немедленно вставить вертикально гребенку в пазы на гелевой рамке на расстоянии примерно 2 см от начала геля. Гребенка позволяет создать «карманы» для нанесения образцов на гель.

После того как гель полностью затвердеет (через 20 30 мин после заливки), осторожно удалить гребенку, ослабить зажимы заливочного столика и перенести гель вместе с гелевой рамкой в камеру для электрофореза, так чтобы «карманы» располагались вблизи «–», так как отрицательно заряженные молекулы ДНК будут двигаться к «+». Далее залить в камеру буферный раствор таким образом, чтобы гель сверху был покрыт слоем раствора толщиной 4–7 мм.

Приготовление образцов (на двоих студентов). Внести в две пластиковые пробирки автоматической микропипеткой по 30 мкл

102

буферного раствора и по 10 мкл раствора бромфенолового синего. Добавить в первую пробирку 3 мкл раствора ДНК, во вторую – 4 мкл раствора маркера ДНК лямбда / HindIII, перемешать, «сбросить» раствор на дно пробирки при помощи вортекса или вручную.

Проведение электрофореза. Каждому студенту внести микропипеткой по 10 мкл ДНК в два «кармана» геля и в следующие два «кармана» – по 10 мкл маркера.

Закрыть крышку камеры для проведения электрофореза. Подключить электроды к источнику постоянного тока (отрицательно заряженные молекулы ДНК и ее фрагменты движутся к аноду). Установить напряжение на приборе 80 В, включить напряжение. За протеканием электрофореза следят по движению красителя (бромфенолового синего). Когда краситель пройдет 2/3 длины геля, отключить напряжение. Осторожно вынуть гель вместе с гелевой рамкой, перенести в пустую кювету для проявления. Залить раствор бромистого этидия.

ВНИМАНИЕ! Бромистый этидий сильный мутаген. Работу с ним необходимо проводить в перчатках.

Через 30 мин вынуть гель из раствора бромистого этидия вместе с гелевой рамкой. Гель отмыть дистиллированной водой. Вместе с преподавателем поместить гель на гелевой рамке в систему гельдокументации (Bio-Rad) для обнаружения полос ДНК и ее фрагмен-

тов (рис. 5.4).

Рис. 5.4. Система гель-документации (Bio Rad, США)

103

На компьютере запустить программу Quantity One, провести сканирование геля и сохранить картинку в электронном виде. На основании данных о длине ДНК и сайтах рестрикции рассчитать длину фрагментов ДНК для маркера и нарисовать предполагаемую электрофореграмму. Сравнить ее с полученным результатом.

104

Список литературы

1.Кнорре Д. Г., Крылова Л. Ф., Музыкантов В. С. Физическая химия. М. : Высш. шк., 1990.

2.Кнорре Д. Г., Мызина С. Д. Биологическая химия. М. : Высш.

шк., 2012.

3.Айвазов Б. В. Введение в хроматографию. М. : Высш. шк., 1983.

4.Методы исследования нуклеиновых кислот. М. : Мир, 1970.

5.Нуклеиновые кислоты от А до Я / под ред. С. Мюллер. М. : Бином. Лаборатория знаний, 2013.

6.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клониро-

вание. М. : Мир, 1984.

7.Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М. : Наука, 1981.

8.Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник био-

химика. М. : Мир, 1991.

9.Физико-химические методы анализа : учеб. пособие. Ин-т биотехнологии, пищевой и химической инженерии АлтГТУ. [Элек-

тронный ресурс]. URL : https://www.chem-astu.ru/chair/study/PCMA/ move.php?term=kj589fdGtgeb39hjzgDSghsj76fU

10.Научно-производственная фирма «Мета-хром». [Электрон-

ный ресурс]. URL : https://www.meta-chrom.ru/company/articles/ chromatographic-analysis-methods/

11. Биомолекула. [Электронный ресурс]. URL : https://biomolecula.ru/articles/vazhneishie-metody-molekuliarnoi- biologii-i-gennoi-inzhenerii

105