Практикум по биохимии. Ч.I. Физико-химические методы. Учебное пособие

–NO2, >C=N–, азогруппы –N=N– и др. Хромофорные группы сообщают «окраску» молекуле, с которой они связаны. Окраску усиливают (углубляют) так называемые ауксохромные группы, например: оксигруппа –OH, аминогруппа –NH2, которые сами по себе в этой области «прозрачны».

Наличие в молекуле большого числа взаимодействующих между собой π-электронов и неподеленных пар электронов снижает величину кванта энергии, необходимую для перевода молекулы в первое возбужденное состояние.

1.3. Устройство спектрофотометра

Принцип действия спектрофотометра основан на разнице в интенсивности входящего потока света и света, пропущенного через образец. Все спектрофотометры основываются на двух видах принципиальных схем.

В первой схеме световой поток определенной длины волны, промодулированный монохроматором, подается на кювету, содержащую образец, и далее прошедший поток направляется на фотоприемник (рис. 1.2).

Рис. 1.2

Монохроматор – спектральный оптико-механический прибор, предназначенный для выделения монохроматического излучения.

11

Монохроматор состоит из следующих основных частей и узлов: входная спектральная щель, коллиматорный объектив, диспергирующий элемент (призма или дифракционная решетка), фокусирующий объектив, и выходная спектральная щель, которая выделяет излучение, принадлежащее узкому интервалу длин волн (∆λ). Возможность сканирования спектра (выбора нужного спектрального диапазона) обеспечивается путем поворота диспергирующего элемента.

Оптический коллиматор – это устройство для получения пучков параллельных световых лучей. Оптический коллиматор состоит из объектива (в простейшем случае вогнутого зеркала или линзы), в фокальную плоскость которого помещен источник света малой величины (рис. 1.3). Наиболее часто таким предметом служит отверстие

непрозрачной диафрагмы, например узкая щель постоянной или изменяемой ширины.

Вторая принципиальная схема спектрофотометра включает в себя содержащую образец кювету, на которую подается излучение непосредственно от источника света, а потом уже монохроматор выделяет из прошедшего потока полосу спектра в заданном диапазоне длин волн, которая и поступает на фотоприемник.

В наиболее продвинутых моделях спектрофотометров вместо монохроматора имеется полихроматор (рис. 1.4). При этом происходит одновременная регистрация сигнала по всем длинам волн при помощи ПЗС-матрицы (сокр. от «прибор с зарядовой связью») или CCD-матрицы (сокр. от англ. charge-coupled device) – специализированной аналоговой интегральной микросхемы, состоящей из светочувствительных фотодиодов.

Различают две основные конструкции спектрофотометров: однолучевые и двулучевые. В двулучевом спектрофотометре один луч падает на кювету с исследуемым образцом, а второй – на кювету с эталоном. В однолучевом приборе измерения проводятся с помощью коэффициентов коррекции. Двулучевые спектрофотометры более точные, позволяют добиться высокой степени повторяемости

12

результатов, они менее чувствительны к изменению параметров окружающей среды.

Рис. 1.4

Источником ультрафиолетового излучения в спектрофотометрах служит ультрафиолетовый лазер или газоразрядная лампа (ртутная, водородная, ксеноновая и др.).

1.4. Закон Бугера – Ламберта – Бера. Оптическая плотность

Если раствор в кювете поглощает свет с длиной волны λ, то интенсивность выходящего потока Iλ меньше интенсивности падаю-

щего света I . Величина называется спектральным коэффи-

циентом пропускания и является безразмерной величиной, а для ее отображения обычно используются %. Кроме того, существуют коэффициенты поглощения, отражения и рассеяния, которые в сумме

скоэффициентом пропускания дают 1 (или 100 %) в соответствии

сзаконом сохранения энергии.

Поглощение света dIλ в бесконечно тонком слое толщиной dx пропорционально падающему на этот слой потоку Iλ (закон Бугера) и концентрации m поглощающих свет частиц (закон Бера).

13

Следовательно, для слоя dx имеем

где – коэффициент пропорциональности.

Когда толщина слоя x меняется от 0 до L, где L – толщина раствора в кювете, интенсивность света меняется от I до Iλ.

Интегрируя уравнение (3) в этих пределах:

называется оптической плотностью раствора. Оптическая плотность – безразмерная величина, тем не менее для ее обозначения часто используют о.е. (оптические единицы) или AU (absorbance unit). Чем сильнее поглощает раствор свет, тем больше его оптическая плотность. Из сравнения формул (5) и (6) следует

Коэффициент пропорциональности ελ называется молярной экстинкцией (или коэффициентом экстинкции). ελ характеризует способность данного вещества взаимодействовать со световым потоком длины волны λ и зависит от свойств молекулы, природы растворителя, температуры и длины волны.

14

В спектрофотометрии концентрацию m выражают в молях на литр, толщину слоя L – в сантиметрах. Поскольку оптическая плотность – величина безразмерная, ελ имеет размерность л моль–1 см–1. Из уравнения (7) видим, что ελ численно равно Dλ при m = 1 моль/л

и L = 1 см.

Величина ελ при достаточно малых концентрациях вещества m, как правило, не зависит от концентрации, однако в спектроскопии принято начинать исследование с проверки пропорциональности между Dλ и m, т. е. с проверки выполнения закона Бера. Отклонения от этого закона часто имеют место уже при повышении концентрации до 10–3–10–4 моль/л. Эти отклонения вызываются ассоциацией

1.5.Учет поглощения растворителем. Разностный метод измерений

Проходя кювету с исследуемым раствором, световой поток поглощается всеми частицами раствора, в том числе и молекулами растворителя. Поскольку концентрация растворителя велика, необходимым условием для нахождения концентрации растворенного вещества по спектрам является полная прозрачность растворителя. В качестве таких растворителей используются вода, хорошо очищенные спирты, CCl4, гексан и др. Однако даже в этом случае вклад растворителя в поглощение может быть существенным.

Для исключения этого эффекта в спектрофотометрии применяют разностный метод измерений: кювета с исследуемым раствором сравнивается с аналогичной кюветой, заполненной чистым растворителем. Этот принцип использован в современных спектрофотометрах, в которых интенсивность потока света, выходящего из кюветы с раствором, автоматически относится к интенсивности потока света, выходящего из кюветы сравнения, заполненной чистым рас-

творителем чр. В дальнейшем под оптической плотностью мы будем понимать величину, определяемую уравнением

15

Этот закон служит основой для анализа сложных смесей по спектрофотометрическим или колориметрическим данным. Если экстинкция растворенного вещества известна из отдельных измерений и закон Бера выполняется, то, определяя значения Dλ при различных λ, по уравнению (9) можно рассчитать неизвестную концентрацию растворенного вещества m. Однако для сложных смесей результаты таких измерений становятся менее надежными.

1.6. Электронные спектры смеси частиц. Изобестическая точка. Выбор характеристической длины волны

изомерии, ионизации и т. д. Анализ таких смесей представляет одну из наиболее важных задач спектрофотометрии.

Спектрофотометрический метод может быть применен для анализа смеси только в том случае, если спектры компонентов заметно отличаются. Предположим, что спектры чистых веществ А и В имеют вид, представленный на рис. 1.5.

Точка пересечения спектральных кривых называется изобестической. На рис. 1.5 эта точка имеет абсциссу λ*. Покажем, что в изобестической точке (при длине волны λ*) оптическая плотность

16

раствора, подчиняющегося условию (10), не зависит от состава раствора. По определению,

из рабочих растворов не проходит через такую точку, то это может указывать либо на неправильное приготовление растворов (mA + mB ≠ m0), либо на то, что при изменении состава среды изменяются значения экстинкций εА и εВ (нарушение закона Бера).

Выбор характеристической длины волны, на которой проводится анализ, производят исходя из следующих соображений.

Во-первых, точность анализа смеси тем выше, чем больше зна-

17

Следовательно, при заданной толщине кюветы L чувствитель-

Кроме того, не рекомендуется работать на крутом спаде спектральной кривой, например, в точке λ1 (см. рис. 1.5), поскольку в этом случае небольшие отклонения в значениях λ, связанные, например, с неточностью установки длины волны, могут привести к заметной ошибке в значе-

бирают кювету и концентрацию раствора.

Как отмечено выше, работу обычно начинают с проверки закона Бера. С этой целью исследуют растворы при различных концентрациях m. График D = D(m) должен изображаться прямой, проходящей через ноль (рис. 1.7).

1.7. Определение степени диссоциации слабой кислоты по спектрофотометрическим данным

Анализ кислотно-основных равновесий представляет одну из наиболее важных областей приложения спектрофотометрии и колориметрии.

Вода и водные растворы некоторых сильных минеральных кислот и щелочей не поглощают свет в видимой и УФ-областях спек-

18

тра. Это обстоятельство значительно упрощает применение спектрофотометрии к анализу кислотно-основных равновесий.

Рассмотрим реакцию

где АН – слабая кислота; А– – сопряженное основание; m0 – исходная концентрация слабой кислоты; α – степень ее диссоциации. Поскольку H2O и H3O+ не поглощают свет, оптическая плотность раствора на длине волны λ будет равна

Положение равновесия реакции (14) зависит от кислотности среды. При добавлении сильных кислот равновесие смещается влево. Наоборот, при снижении кислотности среды можно полностью сместить равновесие вправо. Изучая спектры поглощения раствора в достаточно кислой среде, получаем спектр недиссоциированных молекул кислоты. Измеряя поглощение в достаточно щелочной среде, устанавливаем спектр анионов кислоты.

Из уравнения, аналогичного уравнению (12)

следует, что зависимость D от pH среды должна иметь вид, представленный на рис. 1.8.

Переходная область (область резкого изменения D) занимает 2–3 единицы рН. При дальнейшем изменении рН (в сторону боль-

ших или меньших значений) D изменяется мало и далее принимает постоянные значения D = Dкисл и D = Dщел.

19

D D

Dкисл.

D

Dщел.

Отсюда можно найти значения экстинкций обеих форм:

Подставляя эти значения в уравнение (17), можно найти концентрации и в данном растворе и степень диссоциации кислоты НА:

Наконец, если измерения ведутся в изобестической точке, D не будет зависеть от рН: на графике получим горизонтальную прямую. Ясно, что в этом случае определить степень диссоциации нельзя.

1.8. Определение константы диссоциации слабой кислоты

Константа диссоциации кислоты АН равна константе равновесия реакции (14)

20