Практикум по биохимии. Ч.I. Физико-химические методы. Учебное пособие

Обычно степень диссоциации определяется не в воде, а в буферном растворе с известным значением рН. Тогда уравнение (20) можно записать в виде

21

С-1. Определение константы ионизации цитидина спектрофотометрическим методом

Цитидин является одним из нуклеозидов, входящих в состав рибонуклеиновых кислот. В водных растворах цитидин (В) протонируется с образованием формы ВН+, что приводит к диссоциации по следующей схеме:

От способности нуклеозидов к ионизации зависят их химические и физические свойства, в частности реакционная способность. Протонирование оснований влияет также на пространственную структуру нуклеиновых кислот и полинуклеотидов.

В настоящей работе ионизация цитидина изучается спектрофотометрическим методом, позволяющим работать с незначительным количеством изучаемого вещества.

Значения находят путем измерений оптической плотности D в содержащих цитидин буферных растворах с известным значением рН, а также величин оптической плотности кислого и щелочного растворов цитидина:

22

Приборы и реактивы:

1)спектрофотометр;

2)кварцевые кюветы толщиной 1 см;

3)рН-метр;

4)мерные колбы на 50 мл;

5)химические стаканы на 50 мл;

6)пипетки на 1, 5 и 10 мл;

7)пробирки;

8)6,6 10–5 М раствор цитидина;

9)0,2 М раствор NaOH;

10)0,4 М раствор муравьиной кислоты;

11)0,1 М раствор HCl;

12)0,1 М раствор NaOH.

Экспериментальная часть

а) Исходные растворы

Приготовить три буферных раствора (HCOONa-HCOOH) с одинаковой концентрацией формиата натрия (0,1 М) и рН, равным соответственно 3,9; 4,1; 4,3. Для этого в три стакана на 50 мл налить по 25 мл 0,2 М раствора NaOH и оттитровать каждый 0,4 М муравьиной кислотой до соответствующего рН с помощью рН-метра, после чего перелить эти растворы в мерные колбы на 50 мл и довести общий объем каждого раствора до метки дистиллированной водой.

б) Рабочие растворы

Готовят растворы № 1–8 в соответствии с приведенной ниже таблицей.

23

Контрольные растворы готовятся аналогично, только вместо раствора цитидина берется такое же количество дистиллированной воды. Для кислых растворов № 1, 3, 4 и 5 готовится один контрольный раствор, содержащий 9 мл воды и 1 мл 0,1 М HCl.

в) Определение характеристической длины волны и изобестической точки

Снять спектры поглощения растворов № 1 и 2 относительно их контрольных растворов в области 240–310 нм. Для этого используется приложение SCAN спектрофотометра VARIAN. Для записи спектров выполните следующие действия.

Проследите, чтобы при включении прибора и установке параметров кюветное отделение было пусто.

Войдите на Рабочем столе в окно приложения SCAN. 1. Установка параметров (диалоговое окно Setup).

Нажмите кнопку Setup или в меню Setup выберите Setup, после чего откроется диалоговое окно установки параметров метода. Выберите вкладку Cary.

a.В полях Start и Stop введите границы диапазона сканирования 310–240 нм.

b.В поле Y mode установите единицы измерения оси ординат (Abs).

c.Введите минимальное (Ymin = –0,05) и максимальное (Ymax = 1) значение шкалы оси ординат.

d.Убедитесь, что опция Cycle Mode не выбрана.

e.Выберите режим работы прибора Dual Beam.

f.В области Scan Control выберите Simple и нажмите Survey скорости сканирования.

g.В области Display Option выберите Overlay Data для рисования спектров растворов 1 и 2 на одном графике.

2.Корректировка базовой линии (Диалоговое окно Setup вкладка Baseline). Выберите опцию Baseline Correction для выполнения корректировки базовой линии для каждой точки данных.

3.Настройка приставок и приспособлений (Диалоговое окно

Setup вкладки Accessories 1 и Accessories 2). Убедитесь, что на вкладках не выбрана ни одна из опций.

4. Диалоговое окно Setup вкладка Sampler. Выберите None.

24

5.Установка параметров печати и отчета (Диалоговое окно

Setup вкладка Reports).

a.Установите флажок у опции User Data Form, Company Logo. Выберите Graph, чтобы включить в отчет график.

b.Настройте опцию Peak Table для отображения в отчете. Выберите All Peaks для выхода всех пиков.

6.Отключение автоматического сохранения данных (Диалоговое

окно Setup вкладка Auto Store). Выберите опцию Storage Off.

7.Установка визуального мониторинга. Установите флаг у опции Show Status Display на любой из вкладок для отображения информации о ходе процесса измерения.

8.Завершение установки параметров. Если все необходимые параметры установлены и удовлетворяют вашим требованиям, нажмите кнопку ОК.

9.Установка нуля. Нажмите кнопку Zero или выберите Zero

вменю Commands для установки нуля.

10.Измерение базовой линии.

a. Нажмите кнопку Baseline.

b. Поместите в кюветное отделение кювету с контролем к раствору № 1. Нажмите кнопку ОК. Система проведет сбор данных, и в поле значения оси ординат появится надпись «baseline».

11.Проведение измерения. Для снятия спектра поместите в кюветное отделение кювету с раствором № 1 и нажмите кнопку Start

из меню Commands.

12.Задание наименования образцов и сохранение полученных данных.

a.После нажатия на кнопку Start откроется диалоговое окно Sample Name. Введите имя образца и нажмите ОК. Программа начнет проводить измерения и отображать результаты в области отчетов.

Сполосните кювету 3 раза дистиллированной водой. Для записи спектра раствора № 2 повторите операции п. 10, 11

и 12а, поместив в кювету сначала контроль к раствору № 2, а затем раствор № 2.

b. Для сохранения данных в текстовом формате зайдите в меню File / Save Data as. Выберите Files of Type: Spreadsheet Ascii [*.CSV].

25

c.Затем для сохранения данных в формате Excel откройте на

Рабочем столе Open Office Calc. Зайдите в меню

Файл |Открыть и откройте свой CSV файл.

d.Для построения графика отметьте три столбца данных (X, Y1 и Y2), убрав лишний столбец.

e.В меню Диаграмма отметьте тип диаграммы: Диаграмма XY. Выберите форму: Только линии.

Сохраните данные в формате Microsoft Excel 97/2000/XP.

По графику определите характеристическую и изобестическую длины волн.

г) Проверка закона Бера. Определение экстинкции протонированного цитидина

На выбранной вами в пункте в) характеристической длине волны замерить оптическую плотность кислых растворов № 3, 4, 5 и 1 (стандарты) против контрольного раствора, содержащего 9 мл Н2О и 1 мл 0,1 М HCl.

Для этого по данным таблицы из пункта б) рассчитайте

Проследите, чтобы при включении прибора и установке параметров кюветное отделение было пусто.

1.Установка параметров сбора данных (Диалоговое окно Setup).

Вменю Setup выберите Setup или нажмите командную кнопку Setup, после чего откроется диалоговое окно установки параметров измерений. Выберите вкладку Cary.

а. В поле Wavelength введите характеристическую длину волны. b. В поле Ave Time установите значение времени усреднения

0,1 секунды.

с. Выберите Replicates.

d.Введите число измерений для каждого образца (2).

e.Из открывающегося поля Y Mode выберите единицы измерения по оси ординат (Abs).

2.Установка калибровки (Диалоговое окно Setup | вкладка

Standards).

a.Перейдите на вкладку Standards для задания стандартов.

26

b.Выберите опцию Calibrate During Run для выполнения калибровки.

c.Выберите единицы измерения концентрации (микромоль/л).

Вполе Standards (Стандарты) введите количество растворов цитидина, которые будут использоваться как стандарты – 5. Под стандартом 1 подразумевается контрольный раствор, 2 – раствор № 3, 3 – раствор № 4, 4 – раствор № 5, 5 – раствор № 1.

Всолонке Conc (концентрация) введите значения концен-

трации для каждого из стандартов.

e.В поле Fit Type выберите тип калибровочной кривой (прямая).

f.Введите требуемое значение R2 или коэффициент корреляции в поле Min R2. Чем ближе значение к 1,000, тем точнее подгонка калибровочной кривой. Обычно используется значение 0,95.

3.Установка образца (Диалоговое окно Setup вкладка Samples).

Вполе Number of Samples введите количество образцов 0.

4.Установка приставок и приспособлений (Диалоговое окно Set-

up вкладки Accessories 1 и Accessories 2). Убедитесь, что на этих вкладках ни одно приспособление не установлено.

5.Диалоговое окно Setup вкладка Sampler. Выберите None.

6.Установка параметров отчета (Диалоговое окно Setup вкладка Reports). Установите флажок у опций Parameters, Company Logo, Results. Выберите Graph, чтобы включить в отчет график.

7.Отключение автоматического сохранения данных (Диалоговое

окно Setup вкладка Auto Store). Выберите опцию Storage Off.

8. Установка визуального мониторинга. Установите флажок у опции Show Status Display для отображения информации о ходе процесса измерения.

9.Завершение установки параметров. Если все необходимые параметры установлены, нажмите кнопку ОК.

10.Установка нуля.

a.Сполосните кювету 3 раза дистиллированной водой. Поместите кювету с контрольным раствором в кюветное отделение спектрофотометра.

b.Нажмите кнопку Zero или выберите Zero в меню Commands для установки нуля.

11.Выполнение измерений оптической плотности.

27

a.Нажмите кнопку Start или выберите команду Start в меню Commands. Откроется диалоговое окно Standard / Sample Selection.

b.Нажмите кнопку ОК.

с. Откроется диалоговое окно Present Standards, предлагая установить соответствующий стандарт в кюветное отделение прибора. Нажмите ОК для начала процесса измерения.

d.Проведите измерение контрольного и остальных растворов (№ 3, 4, 5 и 1). После этого программное обеспечение посчитает калибровку и коэффициент корреляции.

ПРИМЕЧАНИЕ. Если установленный коэффициент корреляции (R2) не соответствует, то программа выдаст сообщение «Min R2 test fail». Когда вы нажмете ОК, программа спросит «There is no valid calibration. Proceed in Intensity (a.u.)?». Если выбрать Cancel, то выполнение будет закончено.

12. Задание наименования образцов и сохранение полученных данных.

a.Для сохранения данных в текстовом формате зайдите в меню File / Save Data as. Выберите File of Type: Spreadsheet Ascii [*.CSV].

b.Затем для сохранения данных в формате Excel откройте на

Рабочем столе Open Office Calc. Зайдите в меню

Файл|Открыть и откройте свой CSV файл.

c.Для построения графика отметьте два столбца данных (X и Y).

d.В меню Диаграмма отметьте тип диаграммы: Диаграмма

XY. Выберите форму: Только точки.

Сохраните данные в формате Microsoft Excel 97/2000/XP.

По полученным данным рассчитать по формуле (9) значение ВН .

д) Определение оптической плотности буферных растворов на характеристической длине волны

На выбранной вами в пункте в) характеристической длине волны измерить оптическую плотность буферных растворов № 6, 7 и 8 против соответствующих контрольных растворов с использованием модуля Simple Reads спектрофотометра VARIAN.

Проследите, чтобы при включении прибора и установке параметров кюветное отделение было пусто.

28

1.Установка параметров сбора данных (Диалоговое окно Setup).

Вменю Setup выберите Setup или нажмите командную кнопку Setup, после чего откроется диалоговое окно установки параметров метода.

а. Выберите Read at Wavelength и введите значение характеристической длины волны.

b. В поле Y Mode выберите единицы измерения (Abs).

с. Нажмите кнопку ОК. Инструмент перейдет на установленную длину волны.

2.Установка нуля.

a.Сполосните кювету 3 раза дистиллированной водой. Поместите кювету с контролем к раствору № 6 в кюветное отделение спектрофотометра.

b.Нажмите кнопку Zero.

3.Проведение измерения.

a.Установите кювету с раствором № 6 в кюветное отделение спектрофотометра.

b.Подождите, пока прибор установит нужное значение длины волны. Текущая длина волны отображается в окне статуса вверху справа.

Нажмите кнопку Read для старта измерений.

Полученные результаты будут отражены в области отчетов.

Аналогичным образом измерьте оптическую плотность растворов № 7 и 8, повторив для этого процедуры 2 и 3 для этих растворов и их контролей.

Использовать эти данные для расчета степени ионизации цитидина.

Обработка результатов

Для буферных растворов № 6, 7 и 8 рассчитать по формуле (26) степень диссоциации α, по формуле (22) – ионную силу раствора, по уравнению (21) – средний коэффициент активности ионов. Зная значения рН этих растворов, по уравнению (25) определить рКа цитидина. Результаты занести в таблицу.

Рассчитать среднюю величину рКа, из нее – среднее значение Ка, сравнить полученные величины с литературными данными.

29

Глава 2. Потенциометрия

2.1. Область приложений метода

Одной из наиболее важных задач потенциометрии является определение концентрации ионов водорода, а также определение констант кислотно-основного равновесия (рН-метрия).

Потенциометрический метод широко используется в клиникобиохимической практике для определения рН биологических жидкостей: крови, молока и молочных продуктов, тканей, содержимого желудка и др., а также при решении различных аналитических задач.

2.2. Возникновение электродного потенциала. Уравнение Нернста

При погружении электрода в среду (раствор или расплав), содержащую ионы, способные обмениваться с электродом, на границе раздела электрод – раствор возникает разность потенциалов, величина и знак которой однозначно определяются природой электрода, средой и внешними термодинамическими параметрами (температура, давление).

Рассмотрим равновесную систему, состоящую из металлического электрода и раствора, содержащего ионы этого металла Ме+n:

Ме/Me+n.

В металлическом электроде атомы металла находятся в равновесии с ионами и электронами. Это соответствует процессу

Ме Ме+n + ne(в металле). (1)

Разность электрических потенциалов между металлом и раствором обозначается / и называется электродным потенциа-

лом. Электродный потенциал Е является выражением стремления положительных ионов перейти из металла в раствор.

Уравнение Нернста для зависимости электродного потенциала от активности ионов в растворе:

30