Практикум по биохимии. Ч.I. Физико-химические методы. Учебное пособие

Строят графическую зависимость, откладывая на оси абсцисс T1 , а на оси ординат (– ln kср.ариф.). Тангенс угла наклона прямой

в этих координатах дает значение ERA , откуда находят ЕА = Rtg .

К-2. Кинетика гидролиза п-нитрофенилфосфата щелочной фосфатазой

Приборы и реактивы:

1)термостат (30 °С);

2)секундомер;

3)спектрофотометр;

4)кювета с длиной оптического пути 1 см;

5)пробирки;

6)пипетки на 1; 2; 5 и 10 мл;

7)ванночка со льдом для хранения раствора фермента;

8)0,02 М раствор NаОН;

9)раствор фермента с активностью 0,1 ФE/мл (готовить в 0,01 М глициновом буфере, рН 10);

10)0,05 М глициновый буфер, рН 10, содержащий 5 10–4 М MgSO4 (раствор В);

11)0,01 M раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом

буфере, рН 10, содержащем 5 10–4 М MgSO4 (раствор А).

Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз сложноэфирной связи в фосфомоноэфирах. Одним из субстратов этого фермента является n-нитрофенилфосфат, который гидролизуется по следующей схеме:

Образующийся в результате реакции n-нитрофенол поглощает свет в видимой области спектра (405–420 нм), что позволяет опре-

61

делять кинетические параметры (Кm и Vmax) этой реакции методом спектрофотометрии.

Экспериментальная часть

а) Приготовление рабочих растворов субстрата

Для опытов приготовить рабочие растворы, содержащие 0,05 М глициновый буфер, рН 10, 5 10–4 М MgSO4 и n-нитрофенилфосфат (субстрат) со следующими концентрациями: 1) 0,01 M (раствор А); 2) 0,005 М; 3) 0,003 М; 4) 0,001 M; 5) 0,0005 М.

Рабочие растворы (2)–(5) следует готовить исходя из раствора А, разбавляя его раствором В. Объем каждого рабочего раствора должен составлять 5 мл.

б) Измерение скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата

1.В пробирку налить 4,5 мл рабочего раствора (1) и поместить ее

втермостат (30 °С). Пока раствор прогревается до температуры термостата (10 мин), приготовить четыре больших пробирки с 9 мл 0,02 М раствора NaOH в каждой.

2.Далее в находящийся в термостате рабочий раствор внести 0,5 мл раствора фермента, перемешать, одновременно включив секундомер. Во время реакции пробирку из термостата не вынимать!

3.Через 2, 5, 10 и 15 мин от начала реакции из реакционной смеси отобрать пробы по 1 мл, быстро вылить их в пробирки с 0,02 М раствором NаОН и тщательно перемешать. Приготовить контрольный раствор, содержащий 0,5 мл рабочего раствора (1) и 4,5 мл

0,02 М NaOH.

4.Замерить оптическую плотность контрольного раствора

(Dконтр.) и каждой отобранной пробы на спектрофотометре в кюветах толщиной 1 см при 400 нм против воздуха.

Результаты кинетических измерений занести в таблицу.

Проделать описанный выше эксперимент для каждого рабочего раствора (2), (3), (4) и (5).

Щелочную фосфатазу в процессе работы хранить в ледяной бане.

62

Обработка результатов

Построить графики зависимости (D-Dконтр.) от t. По начальным линейным участкам кинетических кривых вычислить скорости ре-

акций в ∆∆ в 1/мин, как это показано на рис. 3.3.

Далее рассчитать скорости реакций в моль/л мин, воспользовавшись формулой

где 15,2×103 л/моль см – молярный коэффициент экстинкции n-нитрофенола при 400 нм; 10 – коэффициент, учитывающий разбавление реакционной смеси 0,02 М раствором NaОН при остановке реакции.

Рассчитанные скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата, а также обратные им величины свести в таблицу.

63

Из графика найти значения Vmax и Km, как это показано на рис. 3.2.

К-3. Определение кинетических параметров α-амилазы

Приборы и реактивы:

1)секундомер;

2)спектрофотометр;

3)кювета с длиной оптического пути 1 см;

4)пробирки;

5)пипетки на 50 мкл, 1; 2 и 5 мл;

6)реагент (субстрат) для определения активности α-амилазы Амилаза-Ново-1 АО «Вектор-Бест», содержащий 2,27 10–3 M раствор CNP-мальтотриозида в буфере А и 0,1 %-й детергент;

7)0,05 М морфолиноэтансульфонатный (MES) буфер, рН 6, со-

держащий 5 10–3 М СаСl2, 0,2 М KSCN, 0,0138 М азид натрия (буфер А).

Фермент амилаза катализирует гидролиз 1,4-гликозидных связей в полисахаридах. Активность этого фермента обнаруживают во многих органах и тканях. Определение амилазы в крови используется для диагностики острого панкреатита, поскольку при патологических состояниях поджелудочной железы часто продуцируется и поступает в кровь избыточное количество амилазы.

Самая высокая концентрация фермента отмечается в слюнных железах, которые секретируют амилазу, осуществляющую гидролиз крахмала пищи во рту и пищеводе.

Для определения активности α-амилазы используют синтетический хромогенный субстрат CNP-мальтотриозид CNP-(Glc)3, в котором 2-хлор-4-нитрофенильный остаток (CNP) присоединен гликозидной связью к редуцирующему концу мальтотриозы. Мальтот-

64

риоза представляет собой олигосахарид, состоящий из трех остатков D-глюкозы (Glc), соединенных α-1,4-гликозидными связями.

Гидролиз субстрата CNP-(Glc)3 α-амилазой протекает по следующей схеме:

-амилаза

CNP-(Glc)3

Образующийся в результате реакции 2-хлор-4-нитрофенол (CNP) поглощает свет в видимой области спектра (максимум поглощения 405 нм), что позволяет определять кинетические параметры (Кm и Vmax) этой реакции методом спектрофотометрии.

Экспериментальная часть

а) Приготовление рабочих растворов субстрата (реагента)

Приготовить 5 рабочих растворов (суммарный объем каждого раствора составляет 4 мл) с разными концентрациями субстрата (S), разбавляя реагент буферным раствором А в 2, 5, 10, 20 и 40 раз. Рассчитать в них концентрацию субстрата.

б) Приготовление раствора фермента

Прополоскать рот два раза дистиллированной водой для удаления остатков пищи. Взять в рот 20 мл дистиллированной воды, держать ее во рту около двух минут. Полученную жидкость слить в большую пробирку или колбу. Для использования в качестве раствора фермента аликвоту (0,5 мл или 1 мл) разбавляют в отдельной пробирке дистиллированной водой в 10 раз.

в) Измерение скорости реакции

1. Установить на спектрофотометре длину волны 405 нм.

65

2.Измерить оптическую плотность рабочего раствора, который служит контролем (Dконтр).

3.Перелить раствор из кюветы обратно в пробирку, внести в нее 0,05 мл разбавленной слюны и перемешать, одновременно включив секундомер.

4.Быстро перелить раствор в кювету, в которой будет проводиться реакция – непосредственно в спектрофотометре.

С промежутком в 2–3 мин (для разбавлений субстрата в 2, 5

и10 раз) или 5 мин (для более разбавленных растворов) измерять оптическую плотность (D) против воздуха.

Проделать не менее 6–10 измерений.

5.Результаты кинетических измерений занести в таблицу.

6. Проделать описанный выше эксперимент для каждого рабочего раствора.

г) Обработка результатов

Построить графики зависимости D-Dконтр. от t. По начальным линейным участкам кинетических кривых вычислить скорости ре-

Далее рассчитать скорости реакций в моль/л мин, воспользовавшись формулой

66

Глава 4. Хроматография

4.1. Область приложений

Хроматография – группа современных высокоэффективных методов разделения смесей веществ, основанных на распределении их между двумя фазами в сочетании с перемещением в одной из фаз.

Хроматографические методы широко используются в лаборатории и промышленности для качественного и количественного анализа смесей, идентификации веществ, препаративного разделения и очистки. Аналитические возможности хроматографии нашли широкое применение в физической химии при изучении равновесий, кинетики и механизма химических реакций, растворимости веществ.

Следует подчеркнуть особую роль этих методов в биохимических исследованиях для анализа и выделения в чистом виде белков, аминокислот, компонентов нуклеиновых кислот, антибиотиков, витаминов и других биологически активных веществ.

4.2. Коэффициент распределения

Методы равновесной хроматографии основаны на разном распределении разделяемых веществ между фазами, подвижной и неподвижной.

Рассмотрим систему двух фаз – 1 и 2, которые свободно обмениваются частицами и имеют объемы V1 и V2. Среднее число частиц одного сорта в этих подсистемах – N1 и N2. Предполагается, что эти числа достаточно велики и система находится в термодинамическом равновесии.

Вероятность нахождения частицы в фазе 1 можно определить как отношение числа частиц в этой фазе к общему числу молекул в системе:

Примем во внимание, что после некоторого числа столкновений с другими молекулами в течение времени 1, которое можно назвать средним временем жизни в фазе 1, частица переходит в фазу 2, за-

68

тем вновь возвращается в фазу 1 и т. д. Обозначим среднее время пребывания частицы в среде 2 как 2.

Поскольку выбранная частица ничем не отличается от других, поведение всех частиц должно быть в среднем таким же. Тогда вероятность нахождения частицы в фазе 1 можно выразить через средние времена «жизни» частицы в двух средах как

Концентрация вещества в фазе 1 равна m1, а в фазе 2 – m2:

где N – число Авогадро.

Коэффициент распределения частиц между двумя фазами определяется соотношением сродства вещества к каждой из фаз и равен отношению концентраций вещества в них. Из формулы (3) следует, что

Таким образом, концентрация частиц в подвижной фазе 1 (при заданном объеме) тем больше, чем больше среднее время «жизни» в ней частицы 1 или, что то же самое, чем больше подвижность частицы.

4.3. Основное уравнение равновесной хроматографии

Модель хроматографического процесса

Хотя используемые на практике методы хроматографии весьма различны по техническому исполнению, для всех методов харак-

69

терна одна и та же хроматографическая ситуация, представленная на рис. 4.1. Имеется неподвижная фаза 2, способная растворять или адсорбировать исследуемые частицы, и фаза 1, называемая подвижной (газ или растворитель), которая перемещается относительно неподвижной фазы с некоторой линейной скоростью U0 (cм/с). Находящиеся в подвижной фазе разделяемые вещества перемещаются вместе с ней с той же скоростью U0.

Фазы 1 и 2 находятся обычно в высокодисперсном состоянии для обеспечения максимального контакта между ними, однако для понимания механизма процесса это обстоятельство несущественно и можно рассматривать гипотетическую плоскую границу раздела, как показано на рис. 4.1.

Наконец, удобно отвлечься пока от конкретной геометрической формы хроматографической системы. Показанная на рис. 4.1 модель может быть колонкой, ось которой совпадает с вектором скорости U0, пластинкой и т. д. В принципе, хроматография может быть одномерной, двухмерной или трехмерной. Мы будем рассматривать наиболее простой одномерный случай.

Скорость движения хроматографической зоны

Рассмотрим траекторию abcde некоторой «средней» частицы (см. рис. 4.1). Частица движется в фазе 1 по пути а до тех пор, пока не поглотится фазой 2. Среднее время «жизни» ее в неподвижной

70