Практикум по биохимии. Ч.I. Физико-химические методы. Учебное пособие

Двигаясь со средней скоростью U, зона компонента проходит

этот путь за время Ux .

Примем далее, что на пути х частица испытала n актов поглощения – выделения, причем n достаточно велико, чтобы можно было говорить о «среднем» поведении частицы. В течение времени частица пребывала в фазе 1 n 1 секунд, а в фазе 2 – n 2 секунд, причем n 1 + n 2 = . Средняя скорость частицы

поскольку фактически путь x = U0(n 1) частица прошла в фазе 1 за время n 1, двигаясь со скоростью U0.

Отношение объемов фаз 1 и 2 связано с площадями их сечения S1 и S2 следующим образом:

Используя формулу (7), выразим 1 / 2 из уравнения (4):

Подставляя выражение (8) в уравнение (6), получаем уравнение скорости движения хроматографической зоны:

удовлетворяющее очевидным пределам (5).

72

скоростями U( ), в результате чего зоны компонентов разделяются, что используют для анализа и препаративного разделения.

4.4. Хроматограмма

73

При хроматографии на колонке удобно следить за процессом по времени выхода компонентов из колонки (время элюции), что ведет к обращенной хроматограмме (рис. 4.4, в). Первым выходит ком-

понент, движущийся с максимальной скоростью Uo, последним – наиболее «медленный» из имеющихся в смеси компонент 3.

Хроматография дает информацию о числе, концентрации и природе компонентов. Если зоны хорошо разделены, каждый пик отвечает отдельному компоненту и число их равно числу компонентов смеси. Площадь пика (при пропорциональном детектировании) определяет концентрацию компонента в смеси, наконец, его поло-

жение дает информацию о коэффициенте распределения , что можно использовать для идентификации вещества.

По мере продвижения зон расстояние между ними растет, но одновременно происходит расширение зон, пики становятся менее острыми. Уширение связано с эффектами диффузии, неодинаковостью скоростей по всему сечению вследствие гетерогенности системы, стеночными эффектами, неравновесностью процесса и т. д. На практике стремятся к получению предельно узких пиков, что увеличивает эффективность разделения.

4.5. Виды и приемы хроматографии

Арсенал хроматографических методов, используемых в настоящее время, исключительно широк. Рассмотрим принципы классификации, а также наиболее распространенные виды и приемы хроматографии.

Если исходить из природы неподвижной фазы, принято различать следующие виды хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную, аффинную, а также гель-хроматографию.

При адсорбционной хроматографии роль неподвижной фазы выполняет поверхность твердого сорбента, причем взаимодействие разделяемых веществ с поверхностью осуществляется за счет сил физической адсорбции (включая капиллярную конденсацию в порах твердого тела).

При распределительной хроматографии роль неподвижной фа-

зы выполняет растворитель, нанесенный на твердую насадку; взаимодействие с разделяемыми веществами осуществляется за счет сил объемной сольватации. Этот случай напоминает распределение вещества между двумя несмешивающимися жидкостями.

74

Ионообменная хроматография основана на кулоновском взаи-

модействии ионизированных разделяемых веществ с неподвижной фазой – сорбентом, имеющим на поверхности заряженные группы.

Аффинная хроматография. Неподвижная фаза представляет собой твердый носитель, к которому химически присоединены функциональные группы, избирательно связывающие какой-либо из компонентов разделяемой смеси.

Вгель-хроматографии используется способность гелей с контролируемыми размерами пор сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размером и формой их молекул. Разделение достигается за счет того, что в поры геля способны проникать молекулы с размером ниже некоторой величины и не могут проникать молекулы большего размера.

Исходя из природы подвижной фазы, принято различать газовую

ижидкостную хроматографии. В первом случае подвижная фаза представляет собой газ, во втором – жидкость (элюент).

Взависимости от типа прибора различают хроматографию на

колонках, капиллярах, пластинках, бумаге.

4.6.Хроматография на колонках

Внастоящее время такой тип хроматографии наиболее распространен. Колонка представляет собой стеклянную, пластиковую или металлическую трубку, заполненную неподвижной фазой. Разделяемую смесь вводят в верхнюю часть колонки, затем из резервуара с элюентом пропускают через колонку подвижную фазу. Компоненты смеси выходят из колонки (элюируются) в виде раствора в подвижной фазе.

Колонка работает эффективно, если удается разделить пики выходящих рядом веществ. Широко используемая характеристика эффективности колонки, введенная по аналогии с ректификацией,

– число эквивалентных теоретических тарелок. Математическая модель хроматографической колонки представляет собой колонку с тарелками, на каждой из которых достигается равновесное распределение разделяемого вещества между фазами.

Число эквивалентных теоретических тарелок можно опреде-

лить как среднее число актов поглощения – выделения n при прохождении молекулы через колонку (см. вывод формулы (6)).

75

Среднее расстояние между точками b и d (см. рис. 4.1) равно одному элементарному шагу при разделении компонентов – высоте эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ). ВЭТТ можно опре-

делить как отношение высоты хроматографической колонки (h) к числу теоретических тарелок n:

Чем меньше ВЭТТ, тем выше эффективность колонки. На значение ВЭТТ влияет скорость диффузии и другие факторы. Неправильное, неоднородное заполнение колонки сорбентом приводит к увеличению ВЭТТ. Хроматографию следует проводить в таких условиях, чтобы число эквивалентных теоретических тарелок было максимальным и, следовательно, ВЭТТ – минимальной.

Ниже более подробно рассмотрены бумажная, тонкослойная, ионообменная и гель-хроматографии.

76

4.7. Бумажная хроматография

Бумажная хроматография – метод разделения веществ на фильтровальной бумаге (обычно используют чистую целлюлозу высокой однородности). Движущей силой является капиллярное смачивание, обеспечивающее самопроизвольное течение растворителя по капиллярам целлюлозы. При этом отдельный капилляр, стенки которого образованы пучками целлюлозных волокон, можно сравнить со своеобразной микроколонкой.

Разработано много видов бумажной хроматографии – восходящая, нисходящая, радиальная, двухмерная.

Подвижность веществ характеризуют величиной Rf, которая равна отношению скоростей движения компонента (например, вещества 1) и фронта растворителя:

Отсюда с использованием уравнения (9) находим связь между Rf и коэффициентом распределения :

Величину Rf можно рассчитать как отношение путей, пройденных веществом 1 (H1) и фронтом растворителя (H0), поскольку время их прохождения одинаково и равно времени хроматографии:

и эффективный метод разделения. Главное ее преимущество – быстрота разделения при хорошем его качестве. Неподвижная фаза в методе ТСХ представляет собой стеклянную пластинку или металличе-

77

скую фольгу с нанесенным на нее тонким слоем какого-либо сорбента. За счет сил капиллярного смачивания растворитель быстро продвигается по пластинке, при этом происходит разделение веществ в соответствии с их коэффициентами распределения .

Термин ТСХ объединяет несколько методов. В зависимости от природы применяемого тонкого слоя и механизма взаимодействия хроматографируемого вещества с неподвижной фазой различают представленные далее виды ТСХ.

1.Адсорбционная хроматография. Тонкий слой, чаще всего – силикагель, окись алюминия, кизельгур. Механизм распределения: адсорбция растворенного вещества на поверхности твердой фазы.

2.Распределительная хроматография. Тонкий слой – слабоак-

тивные сорбенты: целлюлоза, гипс, целит, силикагель, пропитанный водой. Механизм: распределение между неподвижной жидкой фазой, закрепленной на сорбенте, и подвижной фазой.

3.Ионообменная хроматография. Тонкий слой – ионообменные смолы: DEАE-целлюлоза, DEАE-сефадексы, дауэксы и др. Механизм распределения: ионный обмен между растворенным веществом и заряженными группами неподвижной фазы.

В каждом конкретном случае могут иметь место различные сочетания этих вариантов. Например, адсорбционная хроматография на силикагеле может сопровождаться или распределительной (силикагель всегда содержит адсорбированную воду, которая, если ее

много, может служить неподвижной фазой), или ионообменной хроматографией (силикагель – высушенный гель слабодиссоциированной кремневой кислоты, при хроматографии оснований проявляет свойства катионообменника). Кроме того, распределительная и ионообменная хроматографии сопровождаются адсорбцией на поверхности неподвижной твердой фазы.

Из рассмотренных вариантов ТСХ чаще применяют адсорбционную хроматографию, которая лучше освоена, проста по выполнению. Более того, для этого метода налажено промышленное производство пластинок с закрепленным слоем силикагеля.

Ниже приведены факторы, от которых зависит способность ве-

ществ к адсорбции.

1. Введение в насыщенные углеводороды двойных связей, и особенно полярных функциональных групп, увеличивает способность этих веществ адсорбироваться. Адсорбционная способ-

78

ность функциональных групп и их полярность увеличиваются в следующем ряду:

СН=СН < ОСН3 < COOR < C=О < CHO < SH < NH2 < OH < СООН. (14)

2.Лучше всего протекает адсорбция из неполярных растворителей.

3.Чем меньше у молекулы стерических затруднений, тем лучше она адсорбируется.

Элюирующая способность растворителей увеличивается с ро-

стом их полярности в таких рядах:

1) гексан < гептан < ССl4 < хлороформ;

2) эфир < этилацетат < ацетон < изопропанол < этанол < метанол

<вода.

4.9. Ионообменная хроматография

При этом виде хроматографии неподвижная фаза представляет собой твердый носитель, содержащий ионные группы (ионит). Если это отрицательно заряженные группы, то он связывает катионы и называется катионитом (катионообменная хроматография).

Сорбент, несущий положительно заряженные группы, – анионит. Хроматографию на анионитах называют анионообменной. В исходном состоянии заряды неподвижной фазы скомпенсированы каки- ми-либо противоионами. При нанесении на ионит смеси разделяемых веществ происходит обмен этих противоионов на одноименно заряженные компоненты разделяемой смеси.

Прочность связывания с носителем пропорциональна заряду вещества, которое можно смыть (элюировать) растворителем или солью, например NaCl. Чем меньше заряд вещества, тем меньшая концентрация соли понадобится для его элюирования.

Число «мест» на ионите ограничено его емкостью – количеством заряженных групп. Емкость определяется как количество милли- грамм-молей вещества, которое связывается 1 г ионообменника.

4.10. Гель-хроматография

Гель-хроматография является одним из методов разделения соединений по молекулярному весу и форме молекул. Метод широко

79

применяется в различных областях химии, биохимии и физической химии биополимеров.

Рассмотрим распределение смеси веществ между двумя фазами, одна из которых представляет собой гранулированный гель в растворителе, который является второй фазой.

Пусть гранулы геля имеют поры, размер которых больше размера молекул одного из компонентов разделяемой смеси. Такой компонент может свободно диффундировать в поры геля, тогда как более крупное вещество из-за стерических препятствий хуже проникает в гранулы геля.

Если таким гелем заполнить хроматографическую колонку и пропустить через нее смесь разделяемых веществ, то компоненты этой смеси будут двигаться по колонке с разной скоростью: крупные быстрее (верхний предел – скорость подвижной фазы), а меньшие более медленно, поскольку их продвижение по колонке будет тормозиться диффузией в неподвижную фазу. В итоге компоненты смеси будут выходить из колонки в порядке уменьшения их молекулярного веса.

В качестве характеристик, позволяющих количественно оценить результаты разделения, выступают объемные соотношения в геле.

Общий объем геля, упакованного в колонку Vt (total volume), складывается из трех величин: 1) V0 – внешний объем (объем растворителя между гранулами); 2) Vi – внутренний объем (объем растворителя внутри гранул); 3) Vm – объем матрицы, т. е. сухого геля.

Vt легко определить, замерив ту часть объема колонки, в которой упакован гель; V0 определяют, пропуская через колонку высокомолекулярное вещество, неспособное проникать в гранулы. Тогда V0 равен объему элюента, сошедшего с колонки от момента нанесения такого вещества до момента его выхода с колонки; Vi зависит от пористости геля. Значением Vm для сильно набухающих гелей можно пренебречь, тогда величину Vi можно рассчитать из формулы

(15): Vi ≈ (Vt – V0).

Для веществ, которые способны проникать в гранулы геля с некоторыми затруднениями, можно оценить доступную часть внут-

80