Практикум по биохимии. Ч.I. Физико-химические методы. Учебное пособие

Для выбранного типа геля (сефадекс G-75) и размеров колонки (25 х 600 мм) оптимальная скорость элюции – около 2 мл в минуту. Фракции рекомендуется отбирать по 5 мл, установив время отбора одной фракции на коллекторе при данной скорости элюции. Заполнить ячейки коллектора пробирками.

Перекрыть колонку и удалить элюент над поверхностью геля. Пипеткой с микровинтом осторожно нанести на гель 1 мл смеси растворов декстрана, цитохрома С и хромата калия. Очень важно при этом не нарушить ровную поверхность геля. Дают смеси впитаться (при этих процедурах гель не должен пересохнуть). После этого осторожно вводят в колонку слой элюента, закрывают сверху пробкой со шлангом, идущим от поставленной выше банки с элюентом, открывают колонку и включают коллектор.

Оптическую плотность во фракциях определяют на ФЭКе в кювете толщиной 5 мм. После измерения оптической плотности раствор из кюветы количественно возвращают в соответствующую пробирку. Выход с колонки декстрана голубого регистрируют на длине волны 670 нм, после чего устанавливают длину волны 400 нм, необходимую для регистрации цитохрома С и хромата калия. Хромат калия элюируется последним. Результаты записывают в виде таблицы «Nфр. – D». После этого коллектор выключают. Не забудьте перекрыть колонку!

Для определения объема фракции – величины, необходимой для расчетов, в мерный цилиндр количественно перенести содержимое

10 15 фракций, замерить объем и рассчитать объем одной

фракции (Vфр.).

Измеряют линейкой величины диаметра колонки и высоты столба геля в колонке, откуда рассчитывают объем Vt. Измеряют также длину и внутренний диаметр шланга, идущего от колонки к коллектору, и рассчитывают его объем.

Строят профиль элюции, откладывая на оси абсцисс номер фракции, а на оси ординат – оптическую плотность. Определяют по графику номера фракций Nфр., соответствующих максимальному значению оптической плотности для каждого из трех пиков.

В соответствии с рис. 4.5 рассчитывают Ve для каждого вещества как Nфр. Vфр.. (Если в начале хроматографии часть элюэнта собирали в цилиндр, Ve каждого пика рассчитывают как Vцил + Nфр. Vфр., где Vцил – объем раствора в цилиндре.)

91

Точное значение Ve получается после вычета поправки

v21 v 2 , где v1 – объем нанесенной на колонку смеси; v2 – объ-

ем шланга, идущего от колонки к коллектору. Далее заполняют таблицу.

По формуле (16) рассчитывают величины Kav для цитохрома С и хромата калия.

Данные свести в таблицу.

Цитохром С Хромат калия

Оценить ширину пиков для цитохрома С и хромата калия, как показано на рис. 4.5. Затем по формулам (10) и (11) рассчитать число эффективных теоретических тарелок n и величину ВЭТТ.

Данные свести в таблицу.

Цитохром С Хромат калия

92

Глава 5. Электрофорез

5.1. Краткое описание метода

Электрофорез – это движение заряженных частиц в растворе под действием электрического поля. При движении заряженной сферической частицы в однородном электрическом поле ее электрофоретическая подвижность

U VE ,

где V – скорость частицы, Е – напряженность электрического поля. Электрофоретическая подвижность определяется условием равенства силы, действующей на частицу со стороны поля, и силы трения, обусловленной вязкостью среды:

QE 6 r V ,

где Q – заряд частицы; r – ее радиус; – вязкость среды.

Таким образом, для свободного электрофореза непроводящей частицы в диэлектрике

UVE 6 Qr .

Вреальных условиях на подвижность заряженной частицы влияют ионная сила раствора (за счет экранировки заряда частицы солями буфера), рН (меняет степень диссоциации, а значит, и эффективный заряд) и др.

При электрофорезе в геле подвижность оказывается меньше, чем

вслучае свободного электрофореза (в растворе):

UU 0 a ,

где U0 – подвижность при свободном электрофорезе, а – коэффициент задержки (а < 1).

93

Коэффициент задержки является параметром, зависящим как от размера пор и природы геля, так и от размеров и формы разделяемых молекул. Таким образом, эффект молекулярного сита, лежащий в основе гель-электрофореза, состоит в том, что отдельные молекулы разделяются не только по их общему электрическому заряду, но также по величине (молекулярный вес) и форме (пространственная структура).

Электрофорез может использоваться для разделения белков, нуклеиновых кислот, нуклеопротеидных комплексов, гликозаминогликанов и др.

При проведении электрофореза в качестве «носителей» жидкой фазы могут использоваться пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальная бумага, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса, гели крахмала, агарозы, полиакриламида и многое другое.

В настоящее время в биохимических исследованиях почти исключительно используются полиакриламидные и агарозные гели.

Рис. 5.1. Структура полиакриламида

Для получения полиакриламидного геля (рис. 5.1) используют акриламид и какой-либо агент, образующий сшивки, как правило, NN'-метиленбисакриламид («бис-акриламид»). Реакцию полимеризации проводят в присутствии инициатора процесса полимериза-

94

ции, обычно это персульфат аммония (ПСА), и катализатора, обычно это N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД).

Агароза – это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который извлекают из некоторых видов морских водорослей. В полимерной цепи агарозы чередуются

-D-галактопираноза и 3,6-ангидро-α-L-галактопираноза (рис. 5.2).

Рис. 5.2. Структура агарозы

Молекулярная масса агарозы составляет 104 105. Гелеобразование идет путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. При нагревании до 50 95 °С (в зависимости от типа агарозы) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – «плавится», а при последующем охлаждении до 30 40 °С затвердевает, образуя гель. Обычно используют гели с содержанием агарозы 0,5 2,5 %.

5.2. Поведение нуклеиновых кислот при гель-электрофорезе

Главное отличие нуклеиновых кислот от других биополимеров – отрицательный и значительный суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты. Величина этого заряда слабо зависит от рН в достаточно широком диапазоне рН, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот, поэтому фракционирование их при электрофорезе в геле идет за счет различия размеров и формы молекул, а не их зарядов.

Выбор геля и его пористости зависит от конкретной задачи. Для разделения коротких фрагментов нуклеиновых кислот – олигонуклеотидов, содержащих единицы и десятки мономерных звеньев, –

95

электрофорез ведут в полиакриламидном геле (ПААГ) с концентрацией от 5 до 20 % в зависимости от задачи.

Для электрофоретического разделения олигонуклеотидов в ПААГ используют вертикальный электрофорез: в верхнюю кювету помещают отрицательно заряженный электрод, а в нижнюю – положительно заряженный электрод (рис. 5.3, А). Движение олигонуклеотидов происходит от «минуса» к «плюсу» (сверху вниз).

Рис. 5.3. А – вертикальный гель-электрофорез в полиакриламидном геле; Б – горизонтальный гель-электрофорез в агарозном геле

Для разделения плазмид, крупных рестриктов ДНК и целых молекул ДНК и РНК-вирусов электрофорез ведут в агарозном геле, так как использование ПААГ для этих целей затруднено из-за его меньшей прочности при необходимой пористости. Такой электрофорез проводится в горизонтальной камере (рис. 5.3, Б).

96

Подвижность ДНК при электрофорезе в агарозном геле определяется пятью главными параметрами.

1.Размер молекул ДНК. Молекулы линейной двуцепочечной ДНК перемещаются в геле предположительно одним концом вперед со скоростями, обратно пропорциональными логарифму их молекулярных масс.

2.Концентрация агарозы. ДНК данного размера перемещаются

вгеле, содержащем разные концентрации агарозы, с разными скоростями. Между логарифмом электрофоретической подвижности

ДНК U и концентрацией геля существует прямая зависимость:

lgU = lgU0 – Кτ,

где U0 – электрофоретическая подвижность частицы в отсутствие геля, Кτ – коэффициент замедления, зависящий от свойств геля,

атакже от величины и формы движущихся молекул.

3.Конформация ДНК. ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформации, например: кольцевая неповрежденная (форма I), кольцевая с одноцепочечным разрывом (форма II) и линейная (форма III), движутся в агарозном геле с разными скоростями. Нативное состояние формы I – сверхскрученное кольцо, свернутое в жгут. Это увеличивает компактность и, следовательно, подвижность при электрофорезе. При наличии единичного разрыва (форма II) жгут разворачивается и силами электростатического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется, компактность молекулы уменьшается, а значит, увеличиваются размеры и снижается электрофоретическая подвижность. Относительная подвижность линейной двунитевой ДНК (форма III) зависит от среднего размера пор геля. В 0,6 %-м геле агарозы скорости движения убывают в порядке I > II > III, а в 1,4 %-м геле порядок движения меняется: III > I > II.

4.Напряженность электрического поля Е. При низких напря-

женностях скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. С увеличением Е уменьшается область эффективного разделения ДНК за счет непропорционального увеличения подвижности высокомолекулярных ДНК. Для оптимального разделения используется Е не более 5 В/см (обычно

0,5–2 В/см).

97

5. Нуклеотидный состав и температура. Электрофоретическое поведение ДНК в агарозных гелях (в отличие от ПААГ) слабо зависит от состава оснований ДНК или от температуры геля в интервале 4–30 °С. Электрофорез проводится при комнатной температуре.

5.3. Лидирующие красители

Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препарат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что и разделяемые макромолекулы. Наибольшее распространение получили ксиленцианол и бромфеноловый синий (БФС).

Для характеристики электрофоретической подвижности в данных условиях принято указывать отношение расстояния, пройденного полосой белка или нуклеиновой кислоты от места нанесения, к расстоянию до полосы красителя в этом же геле. Это отношение, как и в хроматографии, обозначают Rf.

5.4. Визуализация нуклеиновых кислот в геле

Для визуализации олигонуклеотидов в полиакриламидном геле после разделения используют их способность поглощать свет на длине волны 260 нм. Для визуализации гель облучают УФ-светом и обнаруживают участки геля, содержащие олигонуклеотид, поглощающий УФ-излучение.

98

области спектра (λmax = 497 нм) и флуоресцирующий в зеленой об-

ласти (λmax = 520 нм).

SYBR Green I является специфическим красителем для двуцепочечной ДНК, но его можно использовать и для визуализации одноцепочечной ДНК, а также РНК, но со значительно меньшей эффективностью.

100