Практикум по биохимии. Ч.I. Физико-химические методы. Учебное пособие

Для реакций в растворах, как правило, ЕА = 40–130 кДж/моль. В случае мономолекулярных реакций А имеет смысл частоты колебаний по разрываемой связи, причем А ~ 1013 с–1. В случае бимолекулярных реакций А пропорционально числу соударений двух молекул.

Для определения энергии активации исследуют зависимость константы k от температуры. Тангенс угла наклона прямой в координатах ln k – 1 / T равен EA / R. Отсюда находят EA, далее по уравнению Аррениуса можно найти ln A. Значения ЕА и ln A не зависит от температуры.

Глубина реакции – разность между исходной и текущей концентрацией одного из реагентов. С помощью соотношений баланса можно выразить концентрацию каждого компонента через глубину. Вводя глубину х для реакции

записываем кинетическое уравнение

Реакцию называют необратимой, если она в условиях опыта проходит практически до конца. Подчеркивая необратимость, вместо знака равенства ставят стрелку слева направо. Когда наряду с прямой реакцией протекает обратная (справа налево), реакцию в целом называют обратимой. Обратимые реакции не доходят до конца, в системе устанавливается равновесие. Если фиксируют внимание на обратимости, вместо знака равенства ставят две стрелки, например

51

Это случается, если вещество В взято в большом избытке и

входе опыта не меняется. Такие реакции называют реакциями

псевдопервого порядка.

Таким образом, не существует общей простой связи между стехиометрическими коэффициентами, порядком реакции и ее молекулярностью. Определение порядка реакции еще недостаточно для выяснения ее истинной молекулярности.

Для исследования кинетики реакций в растворах можно использовать, например, метод отбора проб, когда из реакционного сосуда пипеткой через определенные интервалы времени отбирают пробы. Для быстрого прекращения реакции пробы выливают в охлажденный растворитель или специальный раствор, который взаимодействует с одним из реагентов. Затем пробы анализируют и по полученным данным находят зависимость глубины превращения от времени.

Другие методы предусматривают слежение за изменением состояния реакционной системы по какому-либо суммарному физи- ко-химическому свойству системы, зависящему от глубины реакции. Такие методы позволяют изучать кинетику непосредственно

вреакционном сосуде.

Если исходные вещества или продукты реакции поглощают свет в ультрафиолетовой или видимой областях спектра, применяется спектрофотометрический метод. Оптическая плотность раствора линейно зависит от концентрации поглощающих частиц, и по ее изменению можно судить о ходе реакции.

В принципе, любой количественный аналитический или физический метод может быть использован с этой целью.

3.2. Кинетика необратимых реакций первого порядка

Кинетическое уравнение для необратимой реакции первого порядка → :

52

Имеем

Отсюда

Измеряя текущую концентрацию продукта В (mB) и зная начальную концентрацию А, находят ряд значений k. Если реакция действительно первого порядка, все значения k в данном опыте будут равны. Так можно не только определить k, но и проверить корректность кинетического уравнения.

3.3. Кинетика ферментативных реакций

Большой вклад в теорию действия ферментов внесли Л. Михаэлис и М. Ментен. Они постулировали, что фермент Е сначала обратимо связывает субстрат с образованием ферментсубстратного комплекса ES, который далее необратимо превращается в продукт реакции Р с освобождением молекулы фермента:

где k1, k –1 и k2 – константы скорости соответствующих реакций. Наиболее медленной и лимитирующей скорость всего процесса

является стадия образования продукта реакции, поэтому начальная скорость реакции

Скорость накопления комплекса ES определяется как

53

где первый член соответствует скорости образования ферментсубстратного комплекса, а второй и третий – скоростям его распада.

Если обозначить общую концентрацию субстрата S, а общую концентрацию фермента Е0, то уравнения баланса по субстрату и ферменту можно представить следующим образом:

Практически всегда концентрация субстрата намного больше концентрации фермента, т. е. S >> E0. Следовательно, величиной [ES] по сравнению с [S] в уравнении (4) можно пренебречь. Поскольку мы определяем начальную скорость реакции, то концентрация продукта реакции [P] в этот момент времени близка к нулю.

Тогда из уравнения (4) следует, что в начале реакции

Выражая из уравнения (5) концентрацию фермента, получаем

Подставляя [S] и [E] из уравнений (6) и (7) в уравнение (3), получаем

Поскольку ES является активной промежуточной частицей, его концентрацию можно считать квазистационарной, следовательно скорость его накопления равна 0:

Решая это уравнение относительно [ES], получаем

.

54

Подставляя значение [ES] в уравнение (2), получаем

График зависимости v0 от S приведен на рис. 3.1. Видно, что скорость реакции растет с ростом концентрации субстрата и при очень высоких концентрациях субстрата стремится к предельному значению k2E0, которое обозначают как Vmax и называют максималь-

ной скоростью реакции.

Отсюда получаем уравнение Михаэлиса

.

(Знак «0» у скорости обычно опускают, хотя следует помнить, что речь всегда идет о начальной скорости ферментативной реакции.)

ции субстрата, при которой скорость

55

ферментативной реакции авнар половине максимально возможной

(см. рис. 3.1).

Зная параметры уравнения Михаэлиса Km и Vmax для данной реакции, можно рассчитать ее скорость при любой концентрации субстрата. Для определения этих параметров удобно воспользоваться обратными величинами скорости реакции и концентрации субстрата.

Из уравнения Михаэлиса следует, что

и предполагает расчет констант скорости и энергии активации процесса, а две другие, ферментативные, имеют целью определение величин и .

56

К-1. Кинетика гидролиза сахарозы

Приборы и реактивы:

1)круговой спектрополяриметр;

2)три термостата (на 30, 40 и 50 °С);

3)секундомер;

4)раствор 0,6 М HCl;

5)раствор 30 % сахарозы;

6)мерные цилиндры на 25 мл;

7)колбы на 100 мл.

Сахароза состоит из глюкозы и фруктозы, соединенных между собой гликозидной связью, которая в водных растворах при нейтральных рН устойчива.

Структурная формула молекулы сахарозы:

-D-глюкопиранозил-(1 2)- -D-фруктофуранозид

При добавлении к раствору сахарозы сильной кислоты гликозидная связь гидролизуется:

H+

С12Н22О11 + Н2О С6Н12О6 + С6Н12О. 6

Целью данной задачи является определение кинетических параметров реакции гидролиза сахарозы в присутствии катализатора – сильной кислоты. В качестве метода исследования выбрана поляриметрия, так как все три (исходное и конечные продукты реакции) вещества имеют в своем составе асимметрические атомы углерода и являются оптически активными (способны вращать плоскость поляризации света).

57

По мере течения реакции правое вращение водного раствора сахарозы будет сменяться левым, поскольку суммарное вращение эквимолярной смеси глюкозы и фруктозы имеет знак «–» и соответствует левому вращению. Получение экспериментальной зависимости уменьшения угла вращения плоскости поляризации от времени реакции (пропорциональное уменьшению концентрации сахарозы в растворе) достаточно для расчета всех кинетических параметров данной реакции.

Устройство поляриметра позволяет вести реакцию гидролиза сахарозы непосредственно в поляриметрической трубке (см. описание).

Экспериментальная часть

Включают термостаты на 30, 40 и 50 °С.

Перед выполнением практической части задачи необходимо ознакомиться с принципом измерений на поляриметре и его устройством.

Определяют нулевое положение шкалы анализатора на приборе. Для этого откручивают одну зажимную обойму трубки, заполняют ее дистиллированной водой и измеряют угол α. (Торцевые стекла перед измерением протирают насухо салфеткой.)

Затем заливают в трубку исходный раствор сахарозы и определяют его угол вращения α. Освоение техники измерений на поляриметре проверяет преподаватель.

Трубку после измерений ополаскивают дистиллированной водой, закрывают и помещают в термостат.

После этого в две больших пробирки (или колбы) заливают с помощью мерных цилиндров по 15 мл 30 %-го раствора сахарозы и 0,6 М НС1, помещают их в термостат и дают растворам прогреться до установленной температуры (около 15 мин).

После прогрева содержимое двух пробирок (30 %-й раствор сахарозы и 0,6 М HCl) смешивают, переливая растворы из пробирок в пустую колбу (или из одной колбы в другую), одновременно включив секундомер, отсчитывающий время реакции.

Вынимают из термостата трубку, заполняют ее реакционной смесью и помещают в термостат. Через 8–10 мин вынимают ее из термостата, вытирают, причем торцевые стекла перед измерением тщательно протирают салфеткой. Измеряют угол вращения αt, фиксируя синхронно время, при котором на поляриметре было достиг-

58

нуто равномерное затемнение полей. Рекомендуется делать это по возможности оперативно, чтобы избежать охлаждения реакционной смеси в трубке.

После этого трубку возвращают в термостат до следующего измерения, которое проводят еще через 8–10 мин (всего 10–12 измерений при 30 °С).

Результаты записывают в таблицу (не забыть, что температуру опыта нужно перевести в градусы Кельвина).

Определяют – угол вращения реакционной смеси при полном гидролизе сахарозы. Для этого либо оставляют реакционную смесь при комнатной температуре на несколько дней, либо прогревают ее

на кипящей водяной бане около 30 мин, после чего измеряют . Величина практически не зависит от температуры.

Аналогично проводят реакции при 40 и 50 °С. Для опытов при каждой из температур готовят свежие реакционные смеси.

Следует иметь в виду, что с повышением температуры скорость реакции и, соответственно, изменение угла вращения будут возрастать, т. е. промежутки времени между измерениями с увеличением температуры реакции следует уменьшить (6–8 мин при 40 °С и 3–4 мин при 50 °С).

Расчеты

Используемые в расчетах углы вращения взять с учетом инструментальной поправки, т. е. вычесть нулевое положение шкалы анализатора (когда трубка была заполнена дистиллированной водой).

1. Определение концентрации исходного раствора сахарозы:

где – измеренный угол вращения для исходного раствора сахарозы; [ ] – удельный угол вращения сахарозы (равен +66,55°); L – длина трубки в дециметрах (измерить самостоятельно).

59

2. Определение угла вращения реакционной смеси в нулевой момент времени реакции:

0 2 ,

где – угол вращения исходного раствора сахарозы (в реакционной смеси раствор сахарозы вдвое разбавлен соляной кислотой). Вели-

чина практически не зависит от температуры.

3.На основании экспериментальных данных строят кинетические кривые – зависимость t от t[с] при каждой температуре.

4.Рассчитывают константы скорости реакции для данных температур, считая ее реакцией псевдопервого порядка, по формуле

0 k = (1/t) ln t .

Для этого заполняют таблицу (t – время от начала реакции).

По полученным значениям k находят среднюю величину константы скорости реакции при каждой температуре kср.ариф..

Константу скорости реакции при каждой температуре находят

В этом случае kгр. = tg , где – угол наклона прямой по отношению к абсциссе.

Находят относительную ошибку между рассчитанным значением kср.ариф. и найденным графически.

5. Определение энергии активации (ЕА).

60