Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Практикум по биохимии. Ч.II. Аналитическая биохимия. Учебное пособие
.pdf
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ
НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Факультет естественных наук
Кафедра молекулярной биологии и биотехнологии
Б. П. Челобанов, Д. С. Новопашина, Л. М. Халимская
ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ
Часть II
Аналитическая биохимия
Учебное пособие
Издание третье, переработанное и дополненное
Новосибирск
2020
УДК 577.1
Ч 390
Практикум по биохимии : учеб. пособие : в 2 ч. /
ISBN 978-5-4437-0921-5
ISBN 978-5-4437-1103-4 (Ч. 2)
© Новосибирский государственный
университет, 2020
© Б. П. Челобанов, Д. С. Новопашина,
Л. М. Халимская, 2020
ББК У072я73-5
Ч 390
Рецензент
проф., канд. хим. наук С. Д. Мызина
Челобанов, Б. П.
Б. П. Челобанов, Д. С. Новопашина, Л. М. Халимская. – 3-е
изд., перераб. и доп. ; Новосиб. гос. ун-т. – Новосибирск :
ИПЦ НГУ, 2020. – Ч. II. Аналитическая биохимия. – 52 с.
ISBN 978-5-4437-0921-5
ISBN 978-5-4437-1103-4 (Ч. 2)
Учебное пособие предназначено для студентов 3-го курса
факультета естественных наук (специальность 06.03.01 «Биология»)
Новосибирского национального исследовательского
государственного университета. Пособие включает в себя вторую
часть практикума по биохимии.
Рекомендовано к печати кафедрой молекулярной биологии и
биотехнологии ФЕН НГУ (выписка из приказа № 1 от
06.09.2019 г.).
УДК 577.1
ББК У072я73-5
3
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие ............................................................................................ 4
Занятие 1. Количественное определение фруктозы ............................ 5
Занятие 2. Количественное определение ксилозы .............................. 9
Занятие 3. Количественное определение содержания глюкозы
в крови глюкозооксидазным методом ................................................ 12
Занятие 4. Количественное определение неорганического фосфата.
Использование неорганического фосфата в метаболизме
дрожжей ................................................................................................. 18
Занятие 5. Количественное определение холестерина и мочевины 23
Занятие 6. Коллоквиум № 1 ................................................................. 30
Занятие 7. Количественное определение ДНК в печени .................. 31
Занятие 8. Количественное определение белка в печени ................. 36
Занятие 9. Определение активности щелочной фосфатазы .............. 41
Занятие 10. Исследование свойств щелочной фосфатазы ................ 45
Занятие 11. Коллоквиум № 2 ............................................................... 49
Список рекомендуемой литературы ................................................... 50
4
Предисловие
Практикум по биохимии на 3-м курсе состоит из двух частей:
физико-химические методы и аналитическая биохимия. Вторая часть
содержит методы количественного определения углеводов,
неорганического фосфата, холестерина, мочевины, ДНК и белков, а
также методы определения активности ферментов. Задачи были
впервые поставлены В. К. Райтом, В. И. Ямковым, З. А. Вишневской
и Н. С. Крыловой.
Основой подготовленного издания послужило разработанное на
кафедре молекулярной биологии и биотехнологии методическое
пособие: Челобанов Б. П., Халимская Л. М. Практикум по биохимии.
Новосибирск : НГУ, 2010. Ч. II. Аналитическая биохимия.
5
Занятие 1. Количественное определение фруктозы
В концентрированных минеральных кислотах углеводы
подвергаются дегидратации и дают фурфурали – альдегидные
производные фурана. Так, например, фруктоза и глюкоза при
нагревании в концентрированном растворе соляной или серной
кислоты превращаются в 5-оксиметилфурфураль по следующей
схеме:
Аналогично пентозы превращаются в фурфураль:
-3H2O
5-Оксиметилфурфураль
или
Глюкоза в
енольной форме
Фруктоза в
фуранозной форме
t oC
концентрированная
кислота
6
Фурфурали конденсируются с резорцином, орцином или
антроном, образуя окрашенные продукты, используемые для
количественного определения углеводов.
O
O
OH
OHH3C
O
резорцин орцин антрон
Количественное определение фруктозы основано на реакции
Селиванова. В основе этой реакции лежит способность кетосахаров
давать окраску с резорцином при нагревании в концентрированной
соляной кислоте. Данная реакция позволяет отличить фруктозу от
глюкозы. Раствор глюкозы дает очень слабую окраску только после
длительного кипячения с резорцином.
Приборы и реактивы:
1) спектрофотометр;
2) 10 мм кюветы;
3) пробирки;
4) пипетки на 200 мкл, 1 и 5 мл;
5) водяная баня (80 °С);
6) весы аналитические;
7) мерная колба;
8) 0,1%-й раствор резорцина в этиловом спирте;
9) 30%-й раствор соляной кислоты;
10) фруктоза;
11) раствор фруктозы неизвестной (для студентов) концентрации
(задача).
7
Экспериментальная часть
а) Построение калибровочной кривой
Приготовить в мерной колбе на 100 мл стандартный раствор
фруктозы с концентрацией 100 мкг/мл. Согласно таблице
приготовить из него в пробирках пять рабочих растворов
с концентрациями 20, 30, 40, 50 и 60 мкг/мл и контрольный раствор.
Номер
раствора
Концентрация
фруктозы, мкг/мл
Объем стандартного
раствора фруктозы, мл
Вода,
мл
1 (контроль) 0 0
1
2
20
0,2
0,8 3 30
0,3
0,7 4 40
0,4
0,6
5
50
0,5
0,5
6
60
0,6
0,4
В каждую пробирку прилить по 1 мл 0,1%-го раствора резорцина
и по 3 мл 30%-й соляной кислоты. Растворы тщательно перемешать
и поставить пробирки в термостат (80 °С) на 8 мин. После
охлаждения измерить оптическую плотность против воздуха ( =
440 нм).
По полученным данным (с учетом контроля) построить
калибровочную кривую, откладывая на оси х концентрацию
фруктозы в мкг/мл, на оси у ‒ оптическую плотность.
б) Определение концентрации фруктозы
В качестве задачи предлагается определить концентрацию
фруктозы в растворе, содержащем от 100 мкг до 1 мг фруктозы в
1 мл.
Для этого в трех пробирках приготовить разведения (в 5, 10 и 20
раз) данного вам раствора (задача). В три другие пробирки отобрать
по 1 мл полученных разбавленных растворов, добавить к ним
резорцин и соляную кислоту, нагреть на водяной бане и измерить
оптическую плотность растворов, как описано в пункте а.
8
По калибровочному графику определить концентрацию фруктозы
в этих растворах. Пересчитать концентрацию фруктозы в задаче с
учетом разведений. Рассчитать среднее значение для трех
разведений по формуле:
.
Сравнить полученные результаты с известным (преподавателю)
значением. Для этого понадобится номер, указанный на пробирке с
задачей. Рассчитать ошибку по формуле:
задср
зад
,
где Х
зад
– концентрация фруктозы в пробе в соответствии с номером
задачи, Хср – среднее значение, полученное экспериментально.
При ошибке более 20 % повторить работу, взяв новый раствор
фруктозы «неизвестной» концентрации.
9
Занятие 2. Количественное определение ксилозы
Пентозы при нагревании с соляной кислотой образуют
окрашенный комплекс с орцином. Эта реакция является
специфической на пентозу, например, рибозу, и позволяет
определять РНК в присутствии ДНК при условии, что в исследуемом
растворе находятся небольшие количества других углеводов. РНК
дает цветную реакцию с орцином, а ДНК – с дифениламином,
и интенсивность окраски пропорциональна содержанию
нуклеиновых кислот.
Приборы и реактивы:
1) спектрофотометр;
2) 3 мм или 10 мм кюветы;
3) пробирки;
4) пипетки на 200 мкл, 1 и 5 мл;
5) водяная баня (100 °С);
6) весы аналитические;
7) мерная колба;
8) раствор орцина (отдельно готовится 0,1%-й раствор хлорного
железа в концентрированной соляной кислоте, а на солянокислом
растворе хлорного железа готовится 0,1%-й раствор орцина);
9) ксилоза;
10) раствор ксилозы неизвестной (для студентов) концентрации
(задача).
Экспериментальная часть
а) Построение калибровочной кривой
Приготовить в мерной колбе на 100 мл стандартный раствор
ксилозы с концентрацией 200 мкг/мл. Согласно таблице приготовить
из него в пробирках пять рабочих растворов с концентрациями 40,
80, 120, 160 и 200 мкг/мл и контрольный раствор.
10
Номер
раствора
Концентрация
ксилозы, мкг/мл
Объем стандартного
раствора ксилозы, мл
Вода,
мл
1 (контроль) 0 0
2
2
40
0,4
1,6 3 80
0,8
1,2 4 120
1,2
0,8 5 160
1,6
0,4 6 200
2,0
0,0
В каждую пробирку прилить по 2 мл раствора орцина. Растворы
тщательно перемешать и поставить пробирки на водяную баню
(100 °С) на 20 мин. После охлаждения измерить оптическую
плотность против воздуха ( = 590 нм) на спектрофотометре.
По полученным данным (с учетом контроля) построить
калибровочную кривую, откладывая на оси х концентрацию ксилозы
в мкг/мл, на оси у ‒ оптическую плотность.
б) Определение концентрации ксилозы
В качестве задачи предлагается определить концентрацию
ксилозы в растворе, содержащем от 400 мкг до 2 мг ксилозы в 1 мл.
Для этого в трех пробирках приготовить разведения (в 5, 10 и 20 раз)
данного вам раствора (задача). В три другие пробирки отобрать по
2 мл полученных разбавленных растворов, добавить к ним орцин,
нагреть на водяной бане и измерить оптическую плотность, как
описано в пункте а.
По калибровочному графику определить концентрацию ксилозы
в трех разведениях раствора. Пересчитать концентрацию ксилозы в
пробе с учетом разведений. Рассчитать среднее значение для трех
разведений по формуле:
.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]