Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Практикум по биохимии. Ч.II. Аналитическая биохимия. Учебное пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 12 / 62 3 4 5 6 > Следующая >>>

Сравнить полученные результаты с известным (преподавателю) значением. Для этого понадобится номер, указанный на пробирке с задачей. Рассчитать ошибку по формуле:

 



задср





зад

 ,

где Х

зад

– концентрация ксилозы в пробе в соответствии с номером

задачи, Хср – среднее значение, полученное экспериментально.

При ошибке более 20 % повторить работу, взяв новый раствор ксилозы «неизвестной» концентрации.

Занятие 3. Количественное определение содержания глюкозы

в крови глюкозооксидазным методом

Определение содержания глюкозы в крови и моче необходимо для диагностики сахарного диабета. Это заболевание обусловлено недостаточностью секреции или эффективности действия инсулина (гормона поджелудочной железы) и приводит к глубоким нарушениям обмена веществ. При диабете наблюдается значительное увеличение уровня глюкозы в крови (гипергликемия) и выведение ее избытка с мочой. В очень тяжелых случаях концентрация глюкозы в крови может быть чрезвычайно высокой – до 100 мМ, что в 25 раз выше нормы (3,3–5,5 мМ). После приема углеводной пищи уровень глюкозы возрастает в течение часа примерно до 8 мМ, а затем через два часа возвращается к норме.

Гипергликемия свидетельствует также о почти полной остановке превращения избытка глюкозы в жирные кислоты, запасаемые в виде жиров. При тяжелом диабете больные теряют вес, так как избыток глюкозы у них не приводит к образованию жира, а попросту выводится с мочой.

Существуют химические и ферментативные методы определения концентрации глюкозы в крови. Химические методы разделяют на редуктометрические и колориметрические методы. Редуктометрические методы основаны на свойстве сахара восстанавливать соли тяжелых металлов в щелочной среде. Колориметрические методы основаны на определении количества окрашенных соединений, образующихся в результате реакций с глюкозой. Среди колориметрических методов орто-толуидиновый метод Гультмана в модификации Хиваринена ‒ Никилла является наиболее точным и рассматривается как унифицированный метод определения глюкозы. Метод состоит в определении интенсивности окрашивания раствора, возникающего при взаимодействии ортотолуидина с глюкозой.

К ферментативным методам относятся гексокиназный и глюкозооксидазный методы. Гексокиназный метод состоит из двух последовательных ферментативных реакций:

Регистрация осуществляется по поглощению света НАДФН на длине волны 340 нм. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Наиболее распространенным в настоящее время является глюкозооксидазный метод, основанный на реакции окисления глюкозы:

Использование этой реакции сводит задачу определения концентрации глюкозы к определению концентрации перекиси водорода. Сегодня в лабораторной практике используют в основном спектрофотометрический и электрохимический методы детекции перекиси водорода. Именно эти два подхода положены в основу работы современных глюкометров.

В проточной измерительной ячейке электрохимического глюкометра находится измерительная камера. Камера с одной стороны ограничена мембраной толщиной около 60 мкм, на которую

сорбирована глюкозооксидаза (ферментная мембрана), а с другой стороны к ней присоединен платиновый электрод.

Для проведения анализа пробу цельной крови разбавляют буферным раствором, в котором происходит разрушение эритроцитов, и вносят в проточную ячейку. Глюкоза окисляется, а образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану к электроду, где окисляется на поверхности платины. Возникающий ток пропорционален числу молекул Н2О2, а следовательно, и количеству глюкозы.

Для определения глюкозы в крови с использованием спектрофотометрического глюкометра используют тест-полоски. Тест-полоска содержит ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу и химические компоненты для образования окрашенного комплекса, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Мембрана действует как резервуар для крови, как фильтр, задерживая клетки крови (эритроциты, лейкоциты и др.), как гладкая оптическая поверхность, от которой отражается свет. После нанесения крови на тест-полоску плазма крови сорбируется мембраной, тогда как клетки крови и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. В результате ферментативных реакций происходит образование окрашенного продукта, а интенсивность

развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.

Предлагаемый в данной работе метод основан на сопряженных ферментативных реакциях с участием глюкозооксидазы и пероксидазы.

При окислении -D-глюкозы кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет 4-аминоантипирин в присутствии фенола c образованием соединения розово-малинового цвета, определяемого спектрофотометрически. Интенсивность окраски полученного продукта пропорциональна содержанию глюкозы.

Приборы и реактивы:

1) спектрофотометр;

2) 3 мм или 10 мм кюветы;

3) термостат, 37 °С;

4) центрифуга;

5) центрифужные пробирки объемом 15 мл;

6) мерные колбы;

7) пипетки на 1 и 5 мл;

8) пробирки;

9) глюкоза;

10) депротеинирующий реактив (0,2 М хлорнокислый литий в

0,9%-м растворе хлористого натрия);

11) ферментативный реагент (9 ед. акт. глюкозооксидазы, 0,7 ед.

акт. пероксидазы, 1 ммоль 4-аминоантипирина, 0,0076 ммоль

фенола в 1 мл 0,1 мМ фосфатного буфера рН 7,0). (Растворы 10 и

11 – из набора реактивов «Новоглюк» ЗАО «Вектор-Бест».)

Экспериментальная часть

Обезглавить крысу. Стекающую кровь собрать в пробирку с депротеинирующим реактивом (из расчета 5 мл депротеинирующего реактива на 0,5 мл крови). Полученный раствор быстро перемешать стеклянной палочкой и перелить в центрифужную пробирку. Центрифугировать 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость (супернатант) аккуратно перенести пипеткой в чистую пробирку.

Для построения калибровочной кривой в мерной колбе на 100 мл приготовить стандартный раствор глюкозы с концентрацией 12 ммоль/л.

В трех пробирках приготовить из него по 4 мл рабочих растворов с концентрациями 3, 6 и 9 ммоль/л.

Аликвоты стандартного и рабочих растворов разбавить точно так же, как и кровь (исключая процедуру центрифугирования), но вместо депротеинирующего реактива использовать дистиллированную воду. Для этого в четыре отдельных пробирки внести по 5 мл воды и 0,5 мл соответствующего раствора глюкозы с концентрациями 3, 6, 9 и 12 ммоль/л (растворы 1‒4).

Для определения концентрации глюкозы в шесть отдельных пробирок внести по 3 мл ферментативного реагента, поместить их в термостат (37 °С) на 5 мин.

В четыре из них добавить по 0,3 мл растворов 1, 2, 3 или 4 (в каждую какой-либо из этих растворов). В пятую пробирку добавить 0,3 мл воды (контрольная проба), в шестую – 0,3 мл полученного из крови супернатанта. Растворы перемешать и выдержать в течение 25 мин при 37 °С.

По истечении времени измерить оптическую плотность против воздуха ( = 490 нм) на спектрофотометре. Окраска стабильна в течение 1 часа.

По полученным данным (1–5 пробирки) построить калибровочную кривую, откладывая на оси х концентрацию глюкозы в ммоль/л, на оси у ‒ оптическую плотность.

Используя калибровочный график, по оптической плотности раствора (пробирка 6) найти концентрацию глюкозы в крови крысы.

Занятие 4. Количественное определение неорганического

фосфата. Использование неорганического фосфата

в метаболизме дрожжей

Количественное определение неорганического фосфата необходимо при исследовании кинетики реакций, катализируемых фосфогидролазами, при определении активности этих ферментов, а также для определения коэффициента молярной экстинкции нуклеиновых кислот и т. д.

Чаще всего для определения фосфата используется его способность взаимодействовать с солью молибденовой кислоты с образованием фосфомолибденового комплекса.

Получившийся комплекс можно потом подвергнуть восстановлению и измерить оптическую плотность окрашенного раствора, пропорциональную количеству фосфата. Однако чувствительность метода, а также продолжительность операций сильно варьируют в зависимости от конкретных условий и природы восстанавливающего агента.

Вместо восстановления фосфомолибденовый комплекс можно обработать неионным детергентом – тритоном Х-100, при этом образуется суспензия, для анализа которой используют два метода ‒ нефелометрический и турбидиметрический.

Нефелометрия – метод исследования и анализа вещества по интенсивности светового потока, рассеиваемого взвешенными частицами данного вещества. Пробу освещают потоком света с интенсивностью I0, а затем определяют интенсивность излучения, рассеянного под определенным углом (например, I90 при 90о). Для очень разбавленных суспензий измерение под углом гораздо чувствительнее, чем измерения, когда источник и приемник излучения находятся на одной линии, поскольку при этом можно наблюдать слабый рассеянный свет на темном фоне. Для измерения интенсивности рассеянного света обычно используются специальные приборы – нефелометры. Следует отметить, что конструкции приборов для нефелометрических и люминесцентных измерений идентичны, поэтому любой флуориметр можно также использовать в качестве нефелометра (правда, ни того ни другого прибора на кафедре нет, поэтому будем использовать другой метод).

Метод, в котором измеряют интенсивность света I, прошедшего через кювету, называют турбидиметрией. При турбидиметрических измерениях величина, называемая мутностью, соответствует оптической плотности и может быть определена из соотношения, аналогичного основному закону поглощения света:

S = lg (I0/I) = k L N, где S – мутность; I – интенсивность света, прошедшего через кювету; k – коэффициент пропорциональности, называемый коэффициентом

мутности; L – толщина кюветы; N – число рассеивающих частиц в единице объема.

Для турбидиметрических измерений можно использовать любой

спектрофотометр.

Ниже описан один из достаточно чувствительных методов ‒

определение неорганического фосфата, основанный на турбидиметрическом определении, при котором мутность, развивающаяся при обработке фосфомолибденового комплекса тритоном Х-100, прямо пропорциональна количеству фосфата.

В задаче предлагается исследовать расходование неорганического фосфата, которое в отсутствие кислорода (анаэробные условия) протекает в процессе гликолиза, тогда как в присутствии кислорода фосфат расходуется также и в аэробном процессе – дыхании.

При гликолизе неорганический фосфат расходуется на стадии окисления D-глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат с помощью НАД+. Катализирует эту реакцию фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.

При этом альдегидная группа окисляется до карбоксильной, однако вместо свободной карбоновой кислоты образуется смешанный ангидрид с фосфорной кислотой, т. е. 1,3дифосфоглицерат, который представляет собой

высокоэнергетическое соединение. На следующей стадии гликолиза эта фосфатная группа переносится на АДФ с образованием АТФ.

В присутствии дрожжей в анаэробных условиях далее происходит спиртовое брожение.

При наличии кислорода дрожжи начинают дышать, т. е. происходит окисление образовавшегося в процессе гликолиза пирувата через цикл трикарбоновых кислот и цепь переноса электронов до CO2 и H2O. При этом неорганический фосфат расходуется в реакции с АДФ, приводящей к образованию АТФ:

АДФ + фосфат + Н+ → АТФ + H2O.

Таким образом, происходит конкуренция за неорганический фосфат и АДФ между процессами гликолиза и дыхания. Оба эти процесса приводят к интенсивному использованию неорганического фосфата в метаболизме дрожжей в присутствии кислорода, причем механизмы взаимоотношений анаэробного и аэробного окислительных процессов до конца не изучены.

Приборы и материалы:

1) спектрофотометр;

2) 3 мм или 10 мм кюветы;

3) ледяная баня (0 °С);

4) термостат (37 °С);

5) центрифуга;

6) центрифужные пробирки объемом 15 мл – 4 шт.;

7) пробирки химические – 10 шт.;

8) химический стакан;

9) секундомер;

10) пипетки на 200 мкл, 1 мл и 5 мл;

11) стеклянная палочка.

Реактивы:

1) сухие дрожжи;

2) глюкоза;

<<< < Предыдущая 12 / 62 3 4 5 6 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]