Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Практикум по биохимии. Ч.II. Аналитическая биохимия. Учебное пособие
.pdf
41
Занятие 9. Определение активности щелочной фосфатазы
Щелочная фосфатаза у животных содержится в печени, почках,
кишечнике и сыворотке крови. Систематическое название фермента:
фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты
(К.Ф. 3.1.8.1.). Известно, что щелочная фосфатаза активируется
ионами Mg2+, а ингибируется хелатными агентами и неорганическим
фосфатом. Щелочная фосфатаза имеет широкую специфичность и,
кроме естественных субстратов, обладает способностью отщеплять
ортофосфат от синтетического субстрата n-нитрофенилфосфата по
схеме:
NO
2
O
P O
O
O
+
H2O
NO
2
OH
P
O
O
O
HO
+
n-нитрофенилфосфат n-нитрофенол
Тривиальное название фермента обязано тому, что он наиболее
активен при pH 9–10. В этих условиях остатки аспартата и гистидина,
составляющих каталитический центр фермента, находятся в
депротонированном состоянии и способны связывать ионы
двухвалентных ионов (Zn2+, Mg2+ и некоторые другие) и
фосфатсодержащие субстраты. Фосфатная группа координируется
гуанидиновой группировкой аргинина (Arg
166
). В ходе катализа
происходит фосфорилирование остатка серина (Ser
102
).
Эта реакция чаще всего используется для определения активности
щелочной фосфатазы, так как количество n-нитрофенола, одного из
продуктов реакции, легко может быть определено измерением
оптической плотности при 400–420 нм.
Определение активности щелочной фосфатазы особенно важно
для выявления различных заболеваний, сопровождающихся
отклонением уровня активности этого фермента от нормы. Так,
увеличение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови
может означать заболевание печени или почек, а также оно очень
характерно при рахите. Понижение активности обычно связано с
гипофосфатазией или дефицитом магния.
щелочная
фосфатаза
42
Приборы и материалы:
1) спектрофотометр;
2) 10 мм кюветы;
3) весы технические;
4) термостат (30 °С);
5) секундомер;
6) гомогенизатор;
7) чашки Петри, лед;
8) ножницы;
9) пробирки;
10) пипетки на 1, 2 и 5 мл.
Реактивы:
1) 5,5 мМ раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом
буфере рН 10,0, содержащем 0,5 мМ MgSO4;
2) 0,01 М глициновый буфер рН 10,0;
3) 0,02 М раствор NaOH.
+
-
-
-
43
Экспериментальная часть
а) Приготовление гомогената почек крысы
Крысу забить декапитацией, извлечь почки. Взвесить одну почку,
поместить в чашку Петри (поставленную на лед) и тщательно
измельчить ножницами. Перенести ее в гомогенизатор, помещенный
в ледяную баню, суспендировать в четырех объемах (в мл по
отношению к весу ткани в г) охлажденного до 0 °С 0,01 М
глицинового буфера рН 10,0, и гомогенизировать до однородного
состояния. Гомогенат хранить при 0 °С.
Для определения активности щелочной фосфатазы использовать
гомогенат почек, разбавленный в 10 раз охлажденным до 0 °С 0,01 М
глициновым буфером рН 10,0.
б) Определение активности щелочной фосфатазы при 30 °С
в гомогенате почек крысы
Поместить пробирку с 5 мл 5,5 мМ раствора
n-нитрофенилфосфата в термостат (30 °С, 10 мин).
Приготовить 5 больших пробирок, налив в каждую по 10 мл
0,02 М NaOH.
Внести в находящуюся в термостате пробирку с n-
нитрофенилфосфатом 0,5 мл разбавленного гомогената почек,
перемешать раствор и включить секундомер, не вынимая пробирку
из термостата.
Через 5, 10, 15, 20 и 30 мин от начала реакции из находящейся в
термостате реакционной смеси отобрать пробы по 1 мл, быстро
перенести в заранее приготовленные пробирки с NaOH и
перемешать. Оставить эти пробирки при комнатной температуре.
В отдельной большой пробирке приготовить контрольный
раствор, содержащий 11 мл 0,02 М NaOH, 1 мл 5,5 мМ nнитрофенилфосфата и 100 мкл разбавленного гомогената почек
(компоненты смешивать в указанной последовательности).
Измерить против воздуха оптическую плотность (λ = 400 нм) этих
растворов. Результаты измерений занести в таблицу.
44
Время реакции t,
мин 0 (контроль)
5
10
15
20
30
Оптическая
плотность, D
400
Построить график, откладывая время от начала реакции на оси х,
а разность оптических плотностей проб и контроля на оси у.
По начальному линейному участку кинетической кривой
рассчитать скорость реакции:
t
D
400
ОЕ/мин.
Рассчитать активность щелочной фосфатазы Е на 1 мл гомогената
почек:
Е/мл гомогената почек
2,15
111110
400
t
D
мкМ/мин,
где 15,2 – оптическая плотность 1 мМ раствора n-нитрофенола.
45
Занятие 10. Исследование свойств щелочной фосфатазы
Приборы и материалы:
1) спектрофотометр;
2) 10 мм кюветы;
3) ледяная баня (0 °С);
4) термостаты (30 и 50 °С);
5) секундомер;
6) пробирки 16‒18 шт.;
7) пипетки на 1, 2 и 5 мл.
Реактивы:
1) 5,5 мМ раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом
буфере рН 8,0, содержащем 0,5 мМ MgSO4;
2) 5,5 мМ раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом
буфере рН 10,0, содержащем 0,5 мМ MgSO4;
3) 5,5 мМ раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом
буфере рН 12,0, содержащем 0,5 мМ MgSO4;
4) 0,02 М NaOH;
5) раствор щелочной фосфатазы из кишечника цыплят с
активностью 0,1 ед. акт./мл в 0,01 М глициновом буфере рН 10,0,
содержащем 1%-й тритон Х-100 (хранить в процессе работы на
ледяной бане).
Экспериментальная часть
На занятии выполняется одна из двух ниже описанных работ.
Распределение работ происходит случайным образом. Студенты,
получившие одну пробирку раствора n-нитрофенилфосфата
(в буфере с рН 10,0), исследуют зависимость активности щелочной
фосфатазы от температуры, а получившие три пробирки раствора n-
нитрофенилфосфата (в буфере с рН 8,0, 10,0 и 12,0) исследуют
зависимость активности щелочной фосфатазы от рН.
46
а) Зависимость активности щелочной фосфатазы от
температуры
Описанную ниже процедуру выполняют последовательно (или,
для особо быстрых и ловких студентов, параллельно) при трех
значениях температуры: 0, 30 и 50 °С.
Поместить пробирку с 5 мл 5,5 мМ раствора
n-нитрофенилфосфата в ледяную баню (0 °С, 10 мин) или термостат
(30 или 50°С, 10 мин).
Приготовить 5 больших пробирок, налив в каждую по 10 мл
0,02 М NaOH.
После этого внести в находящуюся в ледяной бане или в
термостате пробирку с n-нитрофенилфосфатом 0,5 мл раствора
фермента, перемешать раствор и включить секундомер, не вынимая
ее из бани или термостата. Через 5, 10, 20, 30 и 40 мин от начала
реакции из реакционной смеси отобрать пробы по 1 мл, быстро
перенести в заранее приготовленные пробирки с NaOH и
перемешать. Оставить эти пробирки при комнатной температуре.
В отдельной большой пробирке приготовить контрольный
раствор, содержащий 11 мл 0,02 М NaOH, 1 мл 5,5 мМ n-
нитрофенилфосфата и 100 мкл раствора фермента (компоненты
смешивать в указанной последовательности). На все три кинетики
готовится один контроль.
Измерить против воздуха оптическую плотность
(λ = 400 нм) этих растворов. Результаты измерений занести в
таблицу.
Время
реакции t,
мин
Оптическая плотность, D
400
0 °С
30 °С
50 °С
0 (контроль)
5
10 20 30 40
47
Далее на одном графике, откладывая на оси х время от начала
реакции, а на оси у оптическую плотность, начертить все
кинетические кривые. По начальным линейным участкам
кинетических кривых вычислить скорость реакции:
400
υ
Dt
ОЕ/мин.
б) Зависимость активности щелочной фосфатазы от
рН среды
Описанную ниже процедуру выполняют последовательно (или,
для особо быстрых и ловких студентов, параллельно) при трех
значениях рН: 8,0, 10,0 и 12,0.
Поместить пробирку с 5 мл 5,5 мМ раствора
n-нитрофенилфосфата (в буфере с рН 8,0, 10,0 или 12,0) в термостат
(30 °С, 10 мин).
Приготовить 5 больших пробирок, налив в каждую по 10 мл
0,02 М NaOH.
После этого внести в пробирку с n-нитрофенилфосфатом 0,5 мл
раствора фермента, перемешать раствор и включить секундомер, не
вынимая ее из термостата. Через 5, 10, 20, 30 и 40 мин от начала
реакции из реакционной смеси отобрать пробы по 1 мл, быстро
перенести в заранее приготовленные пробирки с NaOH и
перемешать. Оставить эти пробирки при комнатной температуре.
В отдельной большой пробирке приготовить контрольный
раствор, содержащий 11 мл 0,02 М NaOH, 1 мл 5,5 мМ
n-нитрофенилфосфата и 100 мкл раствора фермента (компоненты
смешивать в указанной последовательности). Для каждой кинетики
готовится свой контроль.
Измерить против воздуха оптическую плотность (λ = 400 нм) этих
растворов. Результаты измерений занести в таблицу.
48
Время
реакции t,
мин
Оптическая плотность, D
400
рН 8,0
рН 10,0
рН 12,0
0 (контроль)
5
10 20 30 40
Далее на одном графике, откладывая на оси х время от начала
реакции, а на оси у оптическую плотность, начертить все
кинетические кривые. По начальным линейным участкам
кинетических кривых вычислить скорость реакции:
400
υ
D
t
ОЕ/мин.
Построить график зависимости скорости реакции от рН и
определить оптимальное значение рН для реакции гидролиза
n-нитрофенилфосфата щелочной фосфатазой.
49
Занятие 11. Коллоквиум № 2
Вопросы
1) Нуклеиновые кислоты. Состав. Строение. Действие на
нуклеиновые кислоты кислот и щелочей. Количественное
определение нуклеиновых кислот.
2) Белки. Основные особенности строения. Аминокислоты и
пептиды. Пептидная связь. Количественное определение белков.
3) Ферменты. Классификация. Активность ферментов.
Удельная активность. Единицы измерения. Определение активности
ферментов.
50
Список рекомендуемой литературы
1. Кнорре Д. Г., Крылова Л. Ф., Музыкантов В. С. Физическая
химия. М. : Высш. шк., 1990.
2. Кнорре Д. Г., Мызина С. Д. Биологическая химия.
Новосибирск : Изд-во СО РАН, 2012.
3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник
биохимика. М. : Мир, 1991.
4. Биохимия с упражнениями и задачами: учебник для вузов /
под ред. чл.-корр. РАН Е. С. Северина. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010.
5. Маршалл В. Дж., Бангерт С. К. Клиническая биохимия. 6-е
издание., перераб. и доп. М. ‒ СПб. : Изд-во БИНОМ ‒ Диалект, 2015.
6. Labome.com Protein Quantitation Mary Johnson. URL:
https://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]