Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Практикум по биохимии. Ч.II. Аналитическая биохимия. Учебное пособие
.pdf
31
Занятие 7. Количественное определение ДНК в печени
В настоящее время востребованным является определение
конкретных ДНК в биологических и клинических образцах путем
проведения амплификации, обратной транскрипции, ПЦР
в реальном времени, клонирования, секвенирования,
гибридизационного анализа.
Важным этапом этих исследований является выделение
нуклеиновых кислот (НК) – один из базовых методов молекулярной
биологии. Разработано множество специализированных методик,
которые могут использоваться для выделения НК с высокой
степенью очистки. Протокол выделения включает следующие этапы:
(1) клеточный лизис, в результате которого разрушаются клеточные
структуры и образуется лизат; (2) инактивацию нуклеаз клетки,
таких как ДНКазы и РНКазы; (3) выделение искомой нуклеиновой
кислоты из клеточного дебриса.
Современные подходы к выделению нуклеиновых кислот можно
разделить на жидкофазные и твердофазные. Жидкофазный вариант
представляет собой гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформную
экстракцию с использованием реагента TRIzol (смесь фенола,
гуанидин тиоцианата, аммоний тиоцианата, ацетата натрия в воде
с добавлением глицерина). При перемешивании клеточного лизата
и фенола формируются две фазы. ДНК находится в верхней (водной)
фазе, а денатурированные белки ‒ в нижней (органической) фазе. Для
твердофазного выделения нуклеиновых кислот используют
специальные колонки (spin column), силикатные носители (silica
matrix), стеклянные адсорбенты (glass particles), анионообменные
смолы, а также магнитные наноносители (magnetic beads).
Для раздельного определения ДНК и РНК в тканях используется
метод Шмидта ‒ Таннгаузера, разработанный еще в середине
прошлого века и основанный на гидролизе материала слабой
щелочью. В этих условиях происходит расщепление РНК по 3',5'фосфодиэфирным связям до мононуклеотидов, а ДНК остается
устойчивой, что позволяет выделить ее в виде осадка.
В модификации, предложенной Орловыми для определения ДНК,
щелочной гидролиз тканевых препаратов проводят без
предварительного выделения нуклеиновых кислот и удаления
свободных нуклеотидов.
32
На сегодняшний день существует множество способов измерения
концентрации НК. В частности, используется спектрофотомерия,
химические реакции на компоненты нуклеиновых кислот (пентозу
или фосфат), методы с использованием различных
интеркалирующих флуоресцентных красителей, таких как
бромистый этидий, Hoechst 33258, DAPI, SYBR Green II,
акридиновый оранжевый или PicoGreen, а также иммунологические
методы и различные варианты ПЦР.
Спектрофотометрическое определение нуклеиновых кислот
является самым простым и быстрым и основано на том, что
азотистые основания поглощают свет в ультрафиолетовой области
спектра (максимум при 260 нм). Спектроскопический метод
позволяет измерять концентрации НК в диапазоне 10–1000 мкг/мл.
Недостатком этого метода является то, что раствор не должен
содержать примесей другой нуклеиновой кислоты, белков и
низкомолекулярных реагентов, имеющих полосы поглощения
в ультрафиолетовой области.
Методы на основе интеркалирующих флуоресцентных
красителей имеют большую чувствительность, более специфичны
к нуклеиновым кислотам и менее восприимчивы к примесям
веществ, поглощающих свет в ультрафиолетовой области. Так,
бромистый этидий имеет эффект усиления флуоресценции при
образовании комплекса с двойной спиралью ДНК, что позволяет
определять концентрации дц-ДНК в диапазоне 0,5–50 мкг/мл.
Большей чувствительности при выявлении дц-ДНК можно добиться
при использовании таких красителей, как Hoechst 32258, DAPI и
PicoGreen, диапазоны измерения соответственно 10–5000 нг/мл, 0,5–
5000 нг/мл и 25–1000 нг/мл. Некоторые красители, например, SYBR
Green II и акридиновый оранжевый способны связываться как с ДНК,
так и с РНК. При этом комплексы акридинового оранжевого с ДНК
и с РНК имеют различные спектры поглощения и испускания, что
позволяет использовать его для одновременного измерения ДНК
и РНК в смеси. Измерение концентрации нуклеиновых кислот при
помощи флуоресцентных красителей стало, наверное, самым
популярным методом. При этом список возможных флуоресцентных
красителей все время пополняется.
В работе предлагается определить содержание ДНК в печени по
цветовой реакции на дезоксирибозу (по Дише). Минимальная
33
концентрация ДНК, которую можно определить этим методом –
10 мкг/мл.
На первой стадии под действием кислот происходит разрушение
ДНК до нуклеотидов, при этом от пуриновых нуклеотидов
отщепляется дезоксирибоза. Далее дезоксирибоза окисляется,
образуя 5-гидрокси-4-оксипентаналь, который в кислых условиях
димеризуется и взаимодействует с дифениламином, образуя
окрашенный продукт с максимумом поглощения при λ = 595 нм.
Приборы и материалы:
1) спектрофотометр;
2) 10 мм кюветы;
3) водяная баня (100 °С);
4) ледяная баня;
5) морозильная камера (–20 °С);
6) центрифуга;
7) центрифужные пробирки – 2 шт.;
8) химические пробирки – 6 шт.;
9) пипетки на 1, 2 и 5 мл.
Реактивы:
1) 1 М раствор NaOH;
2) насыщенный раствор NaCl в 20%-й CH3COOH;
3) 0,5 М раствор HClO4;
4) реактив Дише: 1 г дифениламина (дважды
перекристализованный из 70%-го этилового спирта) растворяют в
100 мл ледяной уксусной кислоты (х.ч.) и добавляют 2,75 мл
концентрированной H2SO4;
5) 96%-й этиловый спирт;
6) стандартный раствор ДНК (300 мкг/мл).
34
Экспериментальная часть
а) Выделение ДНК
Образец печени (~100 мг) поместить в центрифужную пробирку,
добавить 1 мл 1 М NaOH и при помешивании нагревать на кипящей
водяной бане 5–15 мин. Прозрачный и слегка опалесцирующий
гидролизат охладить до комнатной температуры (5–10 мин), затем
поместить на ледяную баню, добавить 0,5 мл насыщенного раствора
NaCl в 20%-й уксусной кислоте и тщательно перемешать. Через 3–
5 мин выпавший в осадок белок отделить центрифугированием
(3000 об/мин, 5 мин).
Супернатант перенести в другую центрифужную пробирку, а
осадок белка растворить в 1 мл 1 М NaOH (без кипячения), вновь
осадить белок добавлением 0,5 мл насыщенного раствора NaCl в
20%-й уксусной кислоте и центрифугировать (3000 об/мин, 5 мин).
Полученный супернатант объединить с предыдущим, добавить не
менее двух объемов (минимум 6 мл) охлажденного спирта,
тщательно перемешать и поместить в морозильную камеру (–20 °С)
на 30 мин.
Осадок ДНК собрать центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин).
К осадку ДНК добавить 2 мл 0,5 М HClO4 (задача).
35
б) Определение содержания ДНК по цветной реакции на
дезоксирибозу
Согласно таблице из стандартного раствора ДНК приготовить в
пробирках пять рабочих растворов, содержащих от 30 до 300 мкг
ДНК в 1 мл 0,5 М HClO4, контрольный раствор и задачу (2 мл
раствора ДНК, полученные в пункте а).
Номер
пробирки
Концентрация
ДНК,
мкг/мл
Стандартный
раствор ДНК,
мл
0,5 М раствор
HClO4,
мл
1 (контроль)
0 0 2 2 30
0,2
1,8 3 75
0,5
1,5 4 150 1 1 5 300 2 0
6 (задача) ? –
В каждую пробирку добавить по 4 мл реактива Дише. Нагреть их
на кипящей водяной бане 10 мин. При нагревании развивается
устойчивая синяя окраска. Охладить их до комнатной температуры
(5–10 мин). Измерить оптическую плотность против воздуха (λ =
590 нм).
По полученным для пробирок 1–5 данным построить
калибровочную кривую, откладывая на оси х концентрацию ДНК в
мкг/мл, на оси у ‒ оптическую плотность.
Используя калибровочный график, по оптической плотности
раствора (пробирка 6) найти концентрацию ДНК в растворе,
полученном в пункте а (задаче).
Рассчитать содержание ДНК в ткани с учетом объема раствора
ДНК (задача) и веса печени.
36
Занятие 8. Количественное определение белка в печени
Набор методов, используемых для количественного определения
белков, очень широк и включает в себя спектрофотометрию,
химические реакции на компоненты белка, методы с использованием
различных красителей, в том числе и флуоресцентных, а также
иммунологические методы.
Самым простым и быстрым является спектрофотометрическое
определение белка. Большинство белков имеет максимум
поглощения при 280 нм, что обусловлено содержанием в них
остатков триптофана и тирозина. Практически для всех известных
белков коэффициент экстинкции можно найти в справочнике, что
позволяет с хорошей точностью определить концентрацию
известного белка в отсутствие примесей. При исследовании смеси
белков (имеющих разные коэффициенты экстинкции) и в
присутствии нуклеиновых кислот (хотя и имеющих максимум
поглощения при 260 нм, но также значительно поглощающих при
280 нм) ситуация меняется. Для спектрофотометрического
определения концентрации белка в сложных смесях был предложен
ряд методов, основанных на измерении оптической плотности на
разных длинах волн. Так, в методе Варбурга и Христиана,
основанном на измерении оптической плотности при 260 и 280 нм,
учитывается вклад нуклеиновых кислот, а в методе Витакера,
основанном на измерении оптической плотности при 235 и 280 нм,
кроме того, учитывается вклад таких аминокислот, как фенилаланин,
гистидин, метионин и цистеин.
Ряд методов был предложен для определения белка по окраске,
возникающей в результате связывания с красителем. Самый
известный из них и повсеместно распространенный – это метод
Бредфорда, основанный на связывании Кумасси бриллиантового
голубого G-250 с некоторыми аминокислотами.
Данный метод позволяет определить концентрацию белка
в диапазоне 10–100 мкг/мл.
Достоинство этого метода заключается в быстроте и
воспроизводимости анализов, а к недостаткам можно отнести
зависимость интенсивности окраски от аминокислотного состава
белка.
37
Использование флуоресцентных красителей позволяет увеличить
чувствительность на 2–3 порядка. Так, например, NanoOrange
позволяет определить концентрацию белка в диапазоне 10 нг/мл –
10 мкг/мл.
Биуретовый метод основан на образовании в щелочной среде
окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с
ионами двухвалентной меди. Метод достаточно простой, но обладает
низкой чувствительностью (предел обнаружения белка –
300 мкг/мл) и в настоящее время в чистом виде не применяется.
Метод Лоури основан на образовании окрашенных продуктов
ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с
биуретовой реакцией на пептидные связи.
Реагент Фолина представляет собой смесь фосфовольфрамовой и
фосфомолибденовой кислот. После окисления белка (в основном
остатков тирозина) реагент Фолина восстанавливается до оксидов
вольфрама (W8O23) и молибдена (Mo8O23) голубого цвета.
На развитие окраски влияет большое количество веществ:
компоненты буферных систем (трис), восстановители (цистеин,
дитиотреитол, аскорбиновая кислота), комплексоны (ЭДТА),
детергенты (Тритон Х-100), сульфат аммония, сахароза и др.
Интенсивность окрашивания зависит от аминокислотного состава
белка. Кроме того, наблюдается нелинейная зависимость
интенсивности окраски от концентрации белка.
Основные и ароматические
аминокислоты в составе белка
Белок
Кумасси бриллиантовый
голубой G-250
465 нм
38
Предложен ряд модификаций данного метода. В частности,
описанный ниже метод обладает большей чувствительностью и
позволяет определять концентрацию белка в диапазоне 10–
100 мкг/мл. Кроме того, в этом диапазоне зависимость оптической
плотности от концентрации белка линейна. Это достигается за счет
использования более концентрированного раствора тартрата меди,
проведения реакции при повышенной температуре и измерения
оптической плотности при 650 нм, а не при 750 нм (как в
оригинальной методике).
Приборы и материалы:
1) спектрофотометр;
2) 10 мм кюветы;
3) центрифуга;
Комплекс белка с восстановленным
реагентом Фолина (
W8O23 + Mo
8O23
)
max
= 750
нм
Белок
Реагент Фолина
3H2O.P2O
5
.
13WO
3
.
5MO
3
.
10H2O
39
4) весы технические;
5) термостат (50 °С);
6) секундомер;
7) гомогенизатор;
8) чашка Петри;
9) ножницы;
10) пробирки;
11) пипетки на 1, 2 и 5 мл.
Реактивы:
1) 0,01 М трис-HCl pH 8,0;
2) раствор № 1 (2 г тартрата калия, натрия и 100 г Na2CO3
растворить в 500 мл 1 М NaOH и разбавить водой до 1 л);
3) раствор № 2 (2 г тартрата калия, натрия и 1 г CuSO4·5H2O
растворить в 90 мл H2O и добавить 10 мл 1 М NaOH);
4) раствор № 3 (перед занятием 1 объем реактива Фолина
разбавить 15 объемами воды и выдавать студентам
разбавленным). Его концентрацию определяют в отдельном
эксперименте титрованием с помощью 1М NaOH до
рН 10,0. Она должна быть 0,15–0,18 М;
5) бычий сывороточный альбумин (БСА).
Экспериментальная часть
а) Приготовление гомогената печени
Печень взвесить, после чего поместить в чашку Петри и
тщательно измельчить ножницами. Измельченную печень перенести
в гомогенизатор поршневого типа, суспендировать в трех объемах
(в мл по отношению к весу ткани в г) 0,01 М трис-HCl pH 8,0 и
тщательно гомогенизировать. Гомогенат центрифугировать
(3000 об/мин, 15 мин). Аликвоту 0,5 или 1 мл супернатанта развести
водой в 500 раз в мерной колбе на 250 или 500 мл и измерить
концентрацию белка (задача).
40
б) Фотометрическое определение белка модифицированным
методом Лоури
Приготовить в мерной колбе на 100 стандартный раствор БСА
с концентрацией 100 мкг/мл. Согласно таблице приготовить из него
в пробирках 5 рабочих растворов, содержащих от 10 до 100 мкг
белка, контрольный раствор и задачу (1 мл разбавленного в 500 раз
гомогената).
Номер
пробирки
Концентрация
белка, мкг/мл
Стандартный
раствор белка, мл
H2O, мл
1 (контроль) 0 0
1 2 100
1,00
0
3
75
0,75
0,25 4 50
0,50
0,50 5 25
0,25
0,75 6 10
0,10
0,90
7 (задача) ? –
В каждую пробирку добавить по 900 мкл раствора № 1 и
поставить пробирки в термостат (50 °С, 10 мин). Пробирки охладить
до комнатной температуры и добавить по 100 мкл раствора № 2, а
через 10 мин при комнатной температуре – по 3 мл раствора № 3 и
сразу тщательно перемешать. Пробирки поместить в термостат
(50°С, 10 мин). После охлаждения до комнатной температуры
измерить оптическую плотность всех пробирок (λ = 670 нм).
По полученным для пробирок 1‒6 данным построить
калибровочную кривую, откладывая на оси х концентрацию белка в
мкг/мл, на оси у ‒ оптическую плотность.
Используя калибровочный график, по оптической плотности
раствора (пробирка 7) найти концентрацию белка в супернатанте
(задаче). Рассчитать содержание белка в ткани с учетом веса печени,
объема буфера, в котором ее гомогенизировали, и разведения
супернатанта в 500 раз.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]