матки нужно 500 мл среды. Процесс извлечения эмбрионов контролируется ректально.

После завершения промывания одного рога подавали 50 см3 воздуха для полного удаления жидкости из рога и всей системы, выпускали воздух из баллончика, извлекали катетер. Другой стерильный катетер вводят аналогичным образом в противоположный рог матки, и процедура повторяется. Для извлечения эмбрионов нехирургическим методом использовали двухканальные катетеры.

6.3. Оценка качества эмбрионов, их кратковременное культивирование

Качество эмбрионов оценивают в следующей последовательности: после промывания рогов матки коровы-донора флаконы с промывной жидкостью через специальное окошко передаются

вбокс. Затем их помещают на неподвижную поверхность для осаждения эмбрионов. Через 20–30 мин. с помощью сифона аккуратно отсасываютверхнийслойжидкости,оставляя60–100млсосевшими эмбрионами. Отстой разливают в 2–3 чашки Петри (дно чашки предварительно расчерчивают на квадраты 1×1 см для облегчения поиска эмбрионов), затем исследуют под бинокулярной лупой при 15–20-кратном увеличении. Обнаруженные эмбрионы стерильной пипеткой переносят в часовые стекла или маленькие чашки Петри (Ø 40 мм) в 1 мл питательной среды для кратковременного культивирования. После этого эмбрионы оценивают под микроскопом

впроходящем свете при 100–120-кратном увеличении. Основными критериями, по которым производится оценка качества эмбрионов, являются: определение стадии их развития, соответствие уровня дробления возрасту от оплодотворения до извлечения, целостность и форма оболочки, размеры бластомеров и связь между ними. Биологически полноценными считаются эмбрионы, имеющие правильную шарообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, неповрежденную прозрачную оболочку, одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом. Пригодные к пересадке эмбрионы на 7–8-й день после осеменения соответствуют стадиям развития: ранняя и поздняя морула, ранняя и поздняя бластоциста.

38

Для ранней морулы характерно наличие 16–32 бластомеров. Бластомеры разной величины, набухшие, перивителлиновое пространство свободно от отдельных бластомеров. У поздней морулы число бластомеров увеличивается до 32–64. Краевые бластомеры равной величины, завершено уплотнение между бластомерами, отсутствуют разрывы связей между ними.

Нормально развитые эмбрионы содержат неповрежденные равномерные опалесцирующие оболочки и цитоплазму в состоянии дробления, соответствующие возрасту эмбриона. Морула представляет собой скопление бластомеров, не всегда одинаковых по размеру из-за асинхронности дробления. Цитоплазма гомогенная, бластомеры имеют полигональную связь. Перивителлиновое пространство свободно от гранул и включений.

Дегенерированные эмбрионы на 3–4 деления дробления отстают от нормального развития. Они характеризуются распадом бластомеров, смещением или фрагментацией цитоплазмы, наличием в перивителлиновом пространстве гранул, включений. Прозрачная оболочка имеет значительные дефекты в виде множественных трещин, расслоений, разрывов, сколов.

Такие эмбрионы непригодны для трансплантации и подлежат выбраковке. Для морфологической оценки качества эмбрионов используется 5-балльная шкала с условными обозначениями или шкала IETS.

Заморожено-оттаянные эмбрионы оценивают по тем же морфологическим показателям, что свежеполученные. Эмбрионы, имеющие значительные повреждения прозрачной оболочки, разрушение бластомеров, сжатие бластополости, подвергаются дополнительной оценке методом культивирования или выбраковываются.

Для эмбрионов, полученных от коров-доноров мясных пород характерно наличие несколько ослабленной связи между бластомерами. Эмбриональная масса у морул занимает 60–70 % перивителлинового пространства, не имеющего других включений.

Для ранней бластоцисты характерно наличие 64–130 бластомеров. На этой стадии образуются трофобласт и бластополость. Перивителлиновое пространство еще различается. Поздняя бластоциста имеет более 130 бластомеров с четко выраженной бластополостью. Эмбриобласт локализован и отчетливо виден. Трофобласт

39

непрерывный. Зона пеллюцида утончена. Перивителлиновое пространство отсутствует.

Эмбрионы с асинхронным дроблением, с бластомерами разной величины, с повреждением прозрачной оболочки, с лизисом бластомеров и нарушением связи между ними, а также с агглютинацией (разрушением) цитоплазмы, множественными включениями в перивителлиновом пространстве не пригодны для трансплантации. Для неоплодотворенной яйцеклетки характерна однородность клеточной массы, округлая форма, отсутствие бластомеров.

Для морфологической оценки качества морул и бластоцист рекомендуется 5-балльная шкала: отличные – эмбрионы сферической формы,стадияразвитиясоответствуетвозрасту,зародышевыеклетки однородные по размеру и цвету; хорошие – эмбрионы соответствуют стадии развития, но имеются небольшие отклонения: неправильная форма, наличие незначительных включений в перивителлиновом пространстве, выделение одного или нескольких бластомеров, увеличение перивителлинового пространства; удовлетворительные – эмбрионы имеют клетки со структурными отклонениями, деформированные бластомеры, в перивителлиновом пространстве мертвые клетки; условно-годные – эмбрионы с деформированной прозрачной оболочкой, частичным разрушением бластомеров, нарушением связи между ними, фрагментацией цитоплазмы, сжатием бластомеров; неудовлетворительные – эмбрионы, отстающие в развитии, со структурными нарушениями, имеющие клетки разного размера, дефекты прозрачной оболочки (сколы, трещины), содержат включения в перивителлиновом пространстве.

6.4. Криоконсервирование эмбрионов

Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранениякриоконсервированныхэмбрионовзначительнорасширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологической основой селекционной программы.

40

Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Отпадает необходимость в содержании больших стад или групп реципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позвозяет создавать эмбриобанки от генетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По оценке специалистов криоконсервация эмбрионов экономически оправдана, она исключает генетический дрейф, т.е. изменение частоты генов в популяции, вызванные случайными причинами.

При соблюдении правильной биотехнологии выживаемость эмбрионов составляет 90 %, а стельность коров-реципиентов после нехирургической пересадки находится в пределах 50–55 %. Однако нередко в производственных условиях при несоблюдении технологии замораживания-размораживания выживаемость эмбрионов уменьшается, что существенно снижает рентабельность криоконсервации.Обосновано,чтоиспользованиеметодакриоконсервации эмбрионов в производственных условиях является рентабельным только в том случае, если выживаемость эмбрионов после размораживания будет не менее 80 %, а процент стельности коров-реципи- ентов составит 55–60 %.

По принятой в России технологии эмбрионы замораживают с применением автоматических устройств, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах. Эмбрионы замораживают в пробирках 50×6 мм или в ампулах вместимостью 1 мл. В пробирку или ампулу вносят 1–4 эмбриона от одного донора и 0,4 мл раствора криопротектора (1,5 М ДМСО или 10 %-й раствор глицерина). Ампулы перед замораживанием запаивают на пламени газовой горелки. Ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 до –6 °С со скоростью 1 градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0,3 градуса в минуту и погружают в жидкий азот. Применяется также и другой режим: охлаждение от –7 до –35 °С со скоростью 0,3 градуса в минуту; от –35 до –38 °С со скоростью 0,1 градус в минуту и погружение в жидкий азот. Оттаивание эмбрионов производится на водяной

41

бане с температурой 25 или 37 градусов в течение 10–12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионов используют сосуды Дьюара различных типов.

Важнейшее значение для эффективного низкотемпературного замораживания и хранения эмбрионов имеет среда. Чем выше стадия для эмбрионального развития, тем больше потребность в источниках энергии и компонентах, повышающих проницаемость мембран зародышей для различных ионов.

Криоконсерванты или криозащитные среды должны обеспечивать жизнеспособность эмбрионов сельскохозяйственных животных

впромежуток времени от замораживания до пересадки, хранения и оттаивания.

Для замораживания и хранения эмбрионов используют среды, которые составляют, как правило, на основе фосфатно-солевого буфера Дюльбекко. В ее состав входят соли хлористого натрия, калия, магния и кальция, благодаря которым в живой системе поддерживается осмотическое и ионное равновесие.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный и калий фосфорнокислый однозамещенный обеспечивают буферную емкость раствора и рН на уровне 7,2. Пируват натрия и глюкоза являются для эмбриона источниками энергии.

Для поддержания жизни эмбриона необходимо наличие нативных добавок, в качестве которых используют сыворотку крови плода крупного рогатого скота или сыворотку крови других животных

вколичестве 20 % общего объема криозащитной среды. Сыворотка крови содержит ряд факторов, необходимых для поддержания роста клеток зародыша, в том числе гормоны, связанные с белками сыворотки, и полипептиды.

Криосреды являются хорошей питательной средой для бактерий. Поэтому для подавления роста их численности к среде добавляют антибиотики в различных дозах и концентрациях, например, канамицин 100 мкг/мл, гентамицин 20 мкг/мл и другие.

Основной составной частью криозащитных сред являются специальные вещества – криопротекторы (криофилактики). Криопротекторы способны предотвратить повреждение биологических объектов при их замораживании и оттаивании. К ним относятся различные классы химических соединений – спирты, амиды, оксиды, искусственные полимеры и другие.

42

Криопротекторные свойства обнаружены более чем у 100 различных соединений, однако активно используется около 10.

Несмотря на наличие большого числа химических соединений, обладающих криопротекторными свойствами, наиболее широкое распространение в криобиологии получили диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерин.

Первые опыты по низкотемпературному замораживанию эмбрионов крупного рогатого скота проводились с использованием ДМСО следующим образом: насыщение диметилсульфоксидом проводили при комнатной температуре в три этапа: 0,6 М и 1,0 М по 10 мин, в каждом и 1,5 М растворе в течение 20 минут, затем охлаждали до –6 °С со скоростью 1 °С/мин, проводили принудительную кристаллизацию, в дальнейшем охлаждали до –36 °С со скоростью 0,3 °С/мин и до –60 °С со скоростью 0,1 °С/мин и после этого переносили в жидкий азот на хранение.

В настоящее время в качестве криопротектора при низкотемпературном криоконсервировании эмбрионов сельскохозяйственных животных широко применяется глицерин в 1,0–1,4 М концентрациях. Глицерин представляет собой простейший трехатомный спирт, жидкость без цвета и запаха, сладковатого вкуса. Молекулярная масса – 92,1, эмпирическая формула – С3Н8О3, рН 10 %-го раствора составляет 6,0–7,0.

Благодаря наличию гидроксильных групп, глицерин хорошо растворяется в воде, метиловом спирте, ацетоне, не растворяется в жирах и органических растворителях. Глицерин гигроскопичен, он может поглотить из воздуха количество влаги, равное 40 % его массы. Свойства глицерина как растворителя солей аналогичны свойствам воды. При образовании водных растворов молекула глицерина связывает воду, в результате чего вокруг нее образуется гидратная оболочка.

Глицерин широко распространен в природе в составе растительных и животных тканей. Поступая в организм с пищей, он используется для синтеза жиров, аминокислот, превращается в глюкозу, гликоген, включается в энергетический обмен.

Одно из объяснений криозащитного действия глицерина связано с контрактацией объема его в водной среде. При охлаждении глицерин не увеличивается в объеме, а сжимается, что приводит

43

к «гашению» давления водного и криогидратного льда, способствует большей сохранности ультраструктур клетки.

Защитные свойства глицерина связаны также со способностью его витрифицироваться внутри клетки и вызывать переохлаждение внутриклеточной среды. Так, в среде, содержащей глицерин, внутриклеточной кристаллизации при охлаждении клеток даже до –60 °С не наблюдалось. Быстро проникая внутрь клетки, глицерин увеличивает количество связанной воды, стабилизирует ее молекулы, увеличивая их ориентацию, и снижает интенсивность процесса кристаллизации, тем самым он смягчает воздействие на биологические структуры ряда повреждающих факторов.

После оценки клетки эмбрионов насыщают раствором глицерина или диметилсульфоксида различной концентрации двумя способами – одноили многоступенчатым. Как показывают работы многих исследователей, более простым, но жестким является одноступенчатый способ, который обычно используют при наличии эмбрионов отличного качества и при ограниченном времени хранения после извлечения. При этом способе эмбрионы сразу же помещают

вкаплю криопротектора необходимой концентрации и выдерживают

внем 15–20 мин. При использовании многоступенчатого способа эмбрионы последовательно помещают в растворы криопротектора с возрастающими концентрациями и выдерживают несколько минут для уравновешивания осмотического давления.

Контроль за проводкой эмбрионов через ряд повышающихся концентраций глицерина выполняют под микроскопом в стерильном боксе при комнатной температуре. После выдержки в последнем растворе эмбрионы готовы к замораживанию. Эмбрионы замораживают в стеклянных пробирках, или пластиковых соломинках (пайеттах).Послезаправкипробиркузакрываютсверхуфольгой,апайетты закрывают специальными пластиковыми пробками. Следует отметить, что одни исследователи предпочитают использовать пробирки, а другие пайетты.

Емкости с эмбрионами маркируют, все данные записывают

вспециальные журналы.

Подготовленные к криоконсервированию пробирки (пайетты) с эмбрионами помещают в гнездо замораживающей камеры для охлаждения по соответствующему режиму.

44

Оттаивание эмбрионов и подготовку их к пересадке проводят следующим образом. Намеченную пробирку (пайетту) с помощью длинного пинцета быстро извлекают из канистры и помещают в водяную баню с температурой 25 или 37 °С до момента исчезновения льда в контейнере с эмбрионами.

Оттаянные эмбрионы переносят на часовое стекло в растворе криопротектора, проверяют под лупой их наличие и проводят предварительную морфологическую оценку. Затем удаляют криопротектор из эмбрионов, помещая их в подготовленные растворы убывающей концентрации.

После выдержки эмбрионов в растворе криопротектора низкой концентрации их три раза промывают в свежем растворе ФСБ с добавками и помещают под микроскоп при увеличении в 100–150 раз для окончательной оценки качества.

Практика криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота свидетельствует о том, что на выживаемость эмбрионов существенное влияние оказывает не только технология глубокого замораживания и оттаивания, но и их качество и стадия развития. Для успешной криоконсервации следует отбирать эмбрионы без морфологических нарушений, находящиеся на стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты.

Необходимость отбора эмбрионов диктуется еще и тем обстоятельством, что у 10 % из них обнаруживается неправильное развитие, а при криоконсервации повреждаются в среднем еще 25 % клеток бластоцисты. Такие эмбрионы испытывают большую редукцию интактныхбластомеров,вследствиечегопереживаемостьидальнейшее развитие после замораживания и оттаивания существенно нарушаются.

Таким образом, соблюдение правильной биотехнологии криоконсервации и пересадки эмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том же уровне, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации в будущем может быть существенно упрощен, или вообще можно будет отказаться от удаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственно после оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет.

45

Использование технологии криоконсервирования зародышей позволяет сохранить ценный эмбриоматериал при отсутствии жи- вотных-реципиентов, а также проводить трансплантацию эмбрионов в строго определенные сроки с максимальной эффективностью.

Технология глубокого замораживания и оттаивания зародышей предусматривает следующие этапы: выбор криопротектора и приготовление криозащитных растворов; качественная оценка зародышей, насыщение их криопротектором; постепенное охлаждение эмбрионов с помощью программных замораживателей; перенос эмбрионов в жидкий азот и их хранение, оттаивание при определенной температуре; выведение криопротектора из эмбриона; морфологическая оценка зародышей по их пригодности к трансплантации; заправка эмбрионов в пайетты и катетеры; пересадка зародышей реципиентам.

Для криоконсервирования использовали свежеполученные эмбрионы только отличного и хорошего качества. Основным условием при этом является сокращение до минимума времени манипуляций с эмбрионами от момента извлечения до замораживания.

Манипуляции по подготовке зигот к криоконсервированию (оценка их жизнеспособности, насыщение эмбрионов криопротектором, заправка в пайетты) проводили в стерильном боксе. Посудой для проводки эмбрионов служили стерильные часовые стекла с лунками и чашки Петри.

Вкачестве криопротектора используют этиленгликоль. Для насыщения им эмбрионов готовили его растворы с повышающейся концентрацией:

1) 3 части среды для культивирования + 1 часть этиленгликоля; 2) 1 часть среды для культивирования + 1 часть этиленгликоля; 3) 1 часть среды для культивирования + 3 части этиленгликоля; 4) чистый этиленгликоль.

Впервых трех растворах эмбрионы выдерживают по 5 минут,

впоследнем 10 минут.

Эмбрионы с помощью микроаспиратора помещают в пайетты, при заправке которых необходимо соблюдать следующую последовательность: в начале набирают последний раствор криопротектора в количестве 2/5 объема, пузырек воздуха, эмбрион в растворе криопротектора (1/5 объема), пузырек воздуха, раствор криопротектора

46