4. Пересадка эмбрионов

До середины 70-х гг. в основном применяли хирургические способы пересадки эмбрионов коров путем лапаротомии по белой линии живота или в области подвздоха. Первый способ включает общий наркоз коровы, лапаротомию по белой линии живота, извлечение рога матки и введение эмбрионов в верхушку рога матки с малым количеством физиологической среды. В последние годы широко применяется пересадка эмбрионов крупного рогатого скота путем лапаротомии в области подвздоха у животного в стоячем положении с использованием местной анестезии. Подход к репродуктивным органам животного через подвздох исключает травмирование молочной железы коровы, значительно упрощает и ускоряет процесс операции. Эффективность хирургической пересадки эмбрионов высокая, около 60 % и более. Однако нанесенные травмы вследствие резекции мышц, невозможность многократного использования животного, определенная сложность проведения хирургической операции – все это сдерживает широкое использование хирургических методов пересадки эмбрионов крупного рогатого скота в практике животноводства. Поэтому усилия исследователей направлены на разработку нехирургических методов пересадки эмбрионов у этого вида животных.

Многочисленные попытки нехирургической пересадки эмбри- оновкрупногорогатогоскотавплотьдо60-хгг.былибезуспешными. Первая успешная пересадка эмбрионов нехирургическим способом была проведена в 1964 г. Однако эта пересадка представляет лишь исторический интерес, так как эффективность метода была слишком низкой, чтобы иметь практическое значение.

По мнению ряда исследователей, одной из причин неудач при нехирургических пересадках является выброс эмбрионов из полового тракта самки вследствие стимуляции шейки матки при трансцервикальном введении эмбрионов. В целях ограничения выброса из матки пересаженных эмбрионов некоторые исследователи вводили после пересадки зародыша в полость рогов матки коровы углекислый газ, который, по предположению авторов, должен оказывать на матку расслабляющий эффект. Однако при этом эффективность пересадок оставалась низкой.

19

Дальнейшими исследованиями электрической активности миометрия коровы было показано, что активность миометрия проявляется за 3 дня, предшествующих охоте; достигает максимума в день охоты и на следующий день и исчезает на 4–5-й день, что связано с повышением концентрации прогестерона в крови в этот период полового цикла. Уменьшение активности миометрия после 5-го дня цикла является, по-видимому, одной из причин повышения эффективности как хирургических, так и нехирургических пересадок эмбрионов между 6-м и 9-м днями по сравнению с более ранним периодом полового цикла.

Бранд с соавторами установили только неспецифическую электрическую активность миометрия во время процедуры нехирургической пересадки эмбрионов или орошения матки после 5-го дня полового цикла, которая прекращается сразу же после удаления инструмента. Поэтому введение катетеров в рога матки через шейку матки между 6-м и 9-м днями полового цикла не стимулирует сокращения матки, которые могли бы вызвать выброс эмбрионов.

Ввиду того что при нехирургической пересадке катетер касается вульвы, влагалища и шейки матки, которые не являются стерильными, можно предположить, что занос инфекции таким путем может быть одной из причин низкой приживляемости эмбрионов. Установлено, однако, значительное понижение количества микрофлоры в направлении от вульвы к шейке матки, и поэтому при определенных предосторожностях пересадки опасность заноса инфекции в матку маловероятна. Подтверждением этого являются эксперименты указанных авторов по имитации нехирургической пересадки эмбрионов крупного рогатого скота осемененным животным. В опытах авторы не обнаружили заметного вредного влияния проведения катетера в рог матки осемененного животного на дальнейшее течение беременности.

Вместе с тем вероятность заноса инфекции в матку при нехирургической пересадке нельзя исключить. Учитывая тот факт, что чувствительность эндометрия к инфекции повышена в лютеиновую фазу полового цикла по сравнению с периодом охоты, можно ожидать все же снижения приживляемости эмбрионов за счет этого фактора при нехирургической пересадке. Возможно, по этой причине имеет место повышенный процент абортов после нехирургических пересадок эмбрионов.

20

В целях ограничения заноса инфекции при нехирургической пересадке эмбрионов предлагают использовать три концентрические стальные трубки и в качестве внутренней трубки урологический катетер. Авторы получили 40 % приживляемости эмбрионов после пересадки 15 реципиентам на 6–7-й день полового цикла. Аналогичные результаты (43 %) были получены при использовании этогоустройства после пересадкиэмбрионов на 5–6-й деньполового цикла. В результате же пересадки эмбрионов на 4–7-й день получена приживляемость лишь 24 % эмбрионов. Эффективность пересадок с помощью этого устройства в экспериментах колебалась в пределах

8–30 %.

Из известных устройств для нехирургической пересадки эмбрионов крупного рогатого скота наиболее распространенным является катетер Кассу для искусственного осеменения. В первых экспериментах с применением этого устройства была получена низкая (25 %) эффективность пересадки эмбрионов. Однако в следующем эксперименте этого же автора эффективность пересадки эмбрионов повысилась до 60 %. Аналогичная эффективность (50–60 %) нехирургической пересадки эмбрионов с применением инструмента Кассу была подтверждена целым рядом исследователей. Апробированная нами технология пересадки с использованием этого инструмента следующая.

Пайеты и чехлы для катетера стерилизуют, помещая их под ультрафиолетовую лампу на 15–20 мин или в газовую среду окиси этилена. Пайету заполняют с помощью туберкулинового или инсулинового шприца, имеющего переходник из резиновой трубки для соединения с пайетой. Вначале набирают в пайету свежую питательную среду (столбик длиной 1,0–1,3 см), затем небольшой пузырек воздуха (0.5 см) и далее под контролем микроскопа основной объем среды с эмбрионами (2–3 см). После этого насасывают немного воздуха (0,5 см) и питательную среду (1,0–1,5 см). Пайету с эмбрионом помещают в катетер Кассу и до момента пересадки хранят в термостате при температуре +37 °С. Далее под ректальным контролем проводят катетер через шейку матки и осторожно вводят в рог на расстояние 5–7 см от тела матки. Нажатием на шток катетера выдавливают содержимое пайеты вместе с эмбрионом в рог матки, находящийся на стороне яичника с желтым телом. Для удобства в работе

21

вбольшинстве случаев у реципиентов вызывают низкую сакральную эпидуральную анестезию введением 5–7 мл 1,5-го раствора новокаина. Приживляемость эмбрионов в наших экспериментах была около 40 %.

Транспортировка эмбрионов и хранение их в течение 4–6 ч вне организма несколько снижали эффективность нехирургической пересадки (с 40 до 35 %). Однако это понижение эффективности пересадки эмбрионов незначительно, а с учетом транспортировки и условий производства, в которых проводились эксперименты, эти результаты можно считать вполне удовлетворительными.

Существенной причиной низкой эффективности нехирургической пересадки является нанесение травмы эндометрию при введении катетера. Можно предполагать, что попадание крови из поврежденных участков эндометрия губительно действует на жизнеспособность эмбрионов, так как сыворотка крови, не подвергнутая нагреванию, является эмбриотоксической, а гомологичная сыворотка крови является непригодной средой для пересадки эмбрионов. Поэтому при трудном прохождении шейки матки катетером, что, повидимому, сопровождается нанесением большой травмы, эффективность пересадки обычно ниже по сравнению с той, при которой удается легко пройти шейку матки. После легкого прохождения шейки матки приживляемость эмбрионов составила 31,3 %, а при трудном прохождении – 17,1 %. Этим, вероятно, объясняется отмеченная многими авторами существенная разница в эффективности нехирургической пересадки разными техниками. Поэтому навык техника

взначительной мере определяет эффективность нехирургической пересадки эмбрионов.

Вцелях избежания травмы слизистой матки нами предложено устройство для пересадки эмбрионов крупного рогатого скота, состоящее из наружной трубки с острым концом и двух внутренних, одна из которых со сферическим заглушенным концом, в зоне которого расположено отверстие выхода эластичного катетера. При этом ось отверстия направлена в сторону заглушенного конца под углом 105–130° к оси трубки. После проведения низкой сакральной эпидуральной анестезии наружной трубкой со стилетом делают прокол кожи и мышечного слоя у реципиента в области таза в направлении рогов матки. После извлечения стилета в канал наружной трубки

22

вводят вторую и третью трубки, смонтированные с помощью втулки. Затем в канал третьей трубки вводят гибкий катетер, в котором в небольшом объеме среды (0,1 мл) находится эмбрион.

Оператор одной рукой через стенку прямой кишки фиксирует рог матки, второй рукой делает прокол стенки рога матки острым концом второй трубки. При попадании конца трубки в полость матки за счет напряжения пружины выдвигается сферический конец третьей трубки и своим округлым концом отодвигает противоположную стенку рога матки на 5–8 мм. При этом канал третьей трубки открывается в полость рога матки. Легким движением вводят

вполость матки на 50–80 мм катетер и с помощью шприца, одетого на соединительное устройство, порцией среды объемом 1 мл выталкивают эмбрион в полость матки. Устройство обеспечивает контроль попадания эмбриона в просвет рога матки и введение его

взону, удаленную от места прокола стенки рога матки, не вызывает травмирования слизистой шейки и рогов матки. Эффективность использования устройства апробирована на коровах и телках при пересадке эмбрионов неосемененному реципиенту и в небеременный рог матки осемененной корове. В результате применения этого устройства получено 9 телят-трансплантантов, а также один теленок после пересадки эмбриона, полученного сотрудниками ВИЖа от коровыдонора, осемененной яком.

Ввиду того что существует односторонняя взаимосвязь между желтым телом яичника и прилегающим к нему рогом матки, эффективность пересадки эмбриона зависит от места его введения. Пересадка эмбрионов в верхушку рога матки на стороне яичника с желтым телом была эффективной у 85 %, а в противоположный рог – только у 30 % реципиентов.

По мнению одних исследователей, при пересадке эмбрионов хирургическим методом в верхушку и основание рога матки на стороне яичника с желтым телом имеются одинаковые условия для развития эмбрионов, тогда как другие авторы отмечают наличие более благоприятных условий для развития эмбрионов в верхушке рогов матки по сравнению с их основанием.

Эффективность пересадки в значительной степени определяется синхронностью проявления охоты у доноров и реципиентов.

23

Допустимые отклонения для крупного рогатого скота составляют ±2 дня. Однако при точной синхронности проявления охоты у донора и реципиентов может быть достигнута приживляемость 91,1 % эмбрионов при хирургической пересадке по сравнению с 56,5 %, если охота у реципиентов была на 1-й день позднее, чем у донора, и 52,2 % – если на 1 день раньше. В условиях широкого производственного применения пересадки эмбрионов эти различия менее выражены. Так, пересадка 2016 морул сопровождалась беременностью у 62 % реципиентов, проявивших охоту в один день с донорами, и у 60 и 49 % реципиентов, бывших в охотe за один день до или через день после охоты доноров соответственно.

Введение эмбрионов в оба рога матки обеспечивает высокую эффективность пересадки как хирургическим, так и нехирургическим методом. Повышение степени приживляемости эмбрионов при пересадке в оба рога матки может быть обусловлено более высоким выделением лютеотропина двумя эмбрионами или положительным влиянием рога матки с развивающимся эмбрионом на стороне яичника на противоположный рог. Этот прием может быть успешно применен для получения двойневости. Результаты нехирургической пересадки эмбрионов 63 предварительно осемененным реципиентам на трех фермах позволяют считать возможным получение примерно на 30 % больше телят вследствие применения подсадки дополнительного эмбриона в холостой рог матки.

Производственная проверка этого приема была проведена на девяти фермах. Нехирургические пересадки эмбрионов проводили предварительно осемененным коровам без выявления охоты после обработки их прогестагенами путем введения пессариев на 9 дней. У 49 из 84 (58 %) коров, которым наряду с осеменением были пересажены эмбрионы в рог матки, противоположный яичнику с желтым телом, получено 69 телят, или в среднем 1,4 теленка на каждый отел. Двойневость была зарегистрирована у 41 % отелившихся коров. Задержание последа не наблюдалось ни у одной коровы, отелившейся одинцом или двойней, за исключением двух преждевременно отелившихся коров, у которых было отмечено задержание последа. Вес новорожденных телят-двоен составлял 70–71 % от веса телятодинцов. Скорость роста была примерно одинаковой у одинцовых и двойневых телят. По наблюдениям, включающим 350 одинцовых

24

и 250 двойневых телят, масса тела одинцовых телят в 18-месячном возрасте была лишь на 1 % выше, чем у двойневых.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов и производственных испытаний свидетельствуют о возможности значительного повышения двойневости в мясном скотоводстве за счет применения нехирургической пересадки эмбрионов, в частности, осемененному животному в рог матки, противоположный яичнику с желтым телом.

25