6. Технология эмбриотрансплантации

6.1. Осеменение коров-доноров

Результаты суперовуляции определяются эффективным осеменением коров-доноров. Проблема оплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов все еще остается открытой. Как показывают результаты исследований, только 60–65 % эмбрионов пригодны для трансплантации, остальные яйцеклетки, образовавшиеся в результате гормональной обработки гонадотропинами, оказываются либо неоплодотворенными, либо после оплодотворения отстают в развитии или дегенерируют. Причина этих нарушений остается неизвестной.

Для искусственного осеменения коров-доноров необходимо использовать сперму только выдающихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства. Как отмечалось, надежным критерием наследственных качеств быка служит коэффициент повторяемости, т.е. коэффициент регрессии будущих дочерей быка, на число фактически имеющихся дочерей. Если генетическое превосходство дочерей быка, выраженное величиной отклонения от сверстниц, умножить на коэффициент повторяемости, то полученная величина будет характеризовать генетическое превосходство будущих дочерей быка, или предсказанную разность. Предсказанная разность является одним из наиболее объективных качеств быка, разработанных в современной селекции молочного скота.

Для искусственного осеменения коров-доноров следует использовать, как правило, сперму производителей 1-й племенной категории, т.е. таких, племенная ценность которых превышает среднюю популяционную величину на два стандартных отклонения.

Вэтом случае существенно повышаются темпы селекции и улучшается племенная ценность новой генерации.

Племенной подбор быков-производителей и коров-доноров осуществляется по заказному или целевому спариванию родителей.

Вего основе должен лежать принцип индивидуального подбора в соответствии с селекционной программой совершенствования существующих или создания новых пород, типов и линий.

33

Использование сексированного семени позволяет производителям молока отбирать из своего стада и производить ремонтных телок с прекрасной генетикой.

Современные технологии сортировки Х и У-хромосом – несущей спермы требуют индивидуальной идентификации и отбора сперматозоидов в высокоскоростном проточном цитометре.

Потребностьвтелкахстремительнорастет,чтоповышаетспрос на сексированное семя от быков, имеющих большую генетическую ценность. Успех этой технологии зависит в основном от оплодотворяющей способности сортированных сперматозоидов, поскольку это основной фактор, который, таким образом, является наиболее экономически целесообразным.

На сегодняшний день оплодотворяемость различна и зависит от обработки семени после сортировки. Новая техника обработки разрабатывается и, возможно, она повысит уровень оплодотворяемости при использовании сексированного семени. Отбор наиболее подходящих быков и испытания отобранных образцов новым способом являются очень важными для достижения успеха.

Возможность повреждения ДНК во время сортировки, приводящая к отклонениям в развитии эмбриона / плода, заставляет поставить под вопрос широкое применение сексированного семени у КРС. Однако процедура сортировки семени показала себя достаточно безопасной для генетического материала спермы. Более того, крупномасштабные исследования не обнаружили увеличения числа абортов или проблем с продолжительностью периода стельности, гибели новорожденных, затруднений при отеле, изменений в весе новорожденного, мертворождения при использовании сексированного семени для осеменения по сравнению с несексированным семенем. Таким образом, генетическое повреждение спермы во время сортировки является минимальным, если оно вообще существует.

Предлагаемое на рынке сексированное семя часто используется, прежде всего, для телок, поскольку у них выше вероятность оплодотворения, а количество сексированного семени ограничено. Показатели оплодотворяемости, полученные в молочном стаде, колеблются от 30 до 70 % при среднем уровне оплодотворяемости в стаде и факторах управления, оказывающих большое влияние на результаты искусственного осеменения.

34

Требования к оценке оплодотворяющей способности спермы быков, предназначенной для осеменения коров-доноров, должны быть значительно выше, чем при оплодотворении остальных коров. Для повышения оплодотворяемости доноров и выхода эмбрионов, наряду с использованием высококачественной спермы, необходимо определить сроки половой охоты для своевременного проведения искусственного осеменения. Как правило, коров с гормонально вызванной половой охотой осеменяют дважды: первый раз при начале появления половой охоты и второй – через 12–24 часа.

В нашей стране коров-доноров искусственно осеменяют дважды в день с интервалом 10–12 часов каждый раз двумя-тремя дозами замороженной спермы. Так как при суперовуляции повышается число овулировавших яйцеклеток, в каждой дозе спермы должно быть не менее 50 млн подвижных спермиев.

Эффективность искусственного осеменения коров-доноров

всуперовулирующую охоту во многом зависит от правильности выбора оптимального времени для осеменения коров с учетом таких особенностей эструса, как проявление течки, ее интенсивности и длительности, общей реакции возбуждения, охоты и овуляции, качества используемой спермы быков-производителей, а также строгого соблюдения ветеринарно-санитарных требований при выполнении работ.

Течка у коров характеризуется набуханием и покраснением слизистых преддверия влагалища и шейки матки, из половых органов выделяется слизь. У мясного скота продолжительность течки колеблется в пределах от 21 до 44 часов, охота длится от 7 до 12 часов, овуляция наступает через 20–25 часов от начала и 10–15 часов после окончания охоты.

Выявление в охоте проводятся не реже трех раз в день при активных прогулках или пастьбе. Обычно в условиях, отвечающих физиологическим нормам 60–70 % коров приходит в охоту утром, 10 % –

вполдень и 20–30 % вечером. Продолжительность каждого наблюдения составляет 1–2 часа. Охоту считают установленной, если корова не менее двух раз подряд проявила рефлекс неподвижности.

При осеменении необходимо учитывать тот факт, что овуляция наступает через 10–15 часов после окончания охоты, а яйцеклетки при выходе из фолликулов в рог матки способны сохранять

35

жизнеспособность только в течение нескольких часов, поэтому осеменять коров следует перед овуляцией, как можно ближе к ее началу.

Сроки осеменения коров определяют ректально. За 6–12 часов до овуляции в яичнике присутствует зрелый фолликул, представляющий собой пузырек размером 1,5–2 см, при осторожном надавливании на который наблюдается зыбление.

Осеменение доноров осуществляют ректоцервикальным способом, позволяющим контролировать состояние половых органов самки, дважды в день, двойной дозой спермы в тело матки с применением стерильных инструментов одноразового пользования. Для искусственного осеменения использовали семя быков Павлин и Дубок. Первое осеменение проводилось после установления охоты, второе – через 10–12 часов. При необходимости (длительная охота) осеменение повторяли 3–4 раза.

6.2. Нехирургическое извлечение эмбрионов

Эффективность метода трансплантации во многом определяется способом извлечения эмбрионов. Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут быть извлечены тремя способами: после убоя коровы-донора; хирургическим; нехирургическим.

Основное преимущество нехирургического способа извлечения эмбрионов заключается в простоте манипуляций. Для этого не требуется специального операционного помещения. Эмбрионы можно извлекать непосредственно в производственных условиях. С селекционной точки зрения, при правильном применении нехирургического способа воспроизводительная способность доноров не нарушается, что позволяет многократно использовать генетически ценных коровдоноров для получения от них большого числа потомков.

В общем виде извлечение эмбрионов нехирургическим методом происходит по следующей схеме. Коров-доноров обследуют на наличие желтых тел, чистят и моют, ограничивают рацион и кратность кормления, а за сутки прекращают кормление и поение. Перед самым извлечением эмбрионов дезинфицируют наружные половые органы коров-доноров. Извлекают эмбрионы под местной анесте-

36

зией. В рог матки вводят продезинфицированный двухканальный резиновый или пластмассовый катетер с надувным баллончиком, в который нагнетают 10–155 куб. см воздуха. Выход из рога матки закрывают, надувая воздухом тонкостенный резиновый баллончик. Затем в рог вводят промывную жидкость и осторожно массируют, чтобы отделить эмбрионы от стенок матки. В качестве промывной среды применяют PBS до 500 мл. Этот состав используется и для кратковременного культивирования эмбрионов.

Техника нехирургического извлечения эмбрионов включает предварительную оценку половых органов донора (наличие и подсчет желтых тел на каждом из яичников, определение состояния матки и размеров ее рогов). Эмбрионы извлекали на 7-й день после осеменения суперовулирующих доноров. Перед извлечением эмбрионов животное фиксировали в станке, прямую кишку освобождали от фекальных масс. Наружные половые органы и перениальную область тщательно мыли теплой водой с мылом, осушали салфеткой.

Катетер, предназначенный для извлечения эмбрионов, должен быть стерильным. Перед употреблением в полость катетера вставлялиметаллическийстилет,жесткосоединялиспереходником,защищали санитарным чехлом. Инструмент, готовый к работе, смазывали гелем. Раздвигали вульву. Катетер осторожно вводили во влагалище под углом 35–40° таким образом, чтобы он не попал в мочеиспускательный канал. Под ректальным контролем катетер осторожно проводили к шейке матки, прорывали защитный чехол и, осторожно манипулируя шейкой, проводили инструмент в тело матки, направляли его в один из рогов. Дойдя до изгиба рога, отстегивали стилет и извлекали его из катетера на 10 см, затем продвигали катетер за изгиб рога (наиболее оптимальный вариант введения катетера на глубину 15–20 см от маточно-трубного сочленения), подавали в баллончик 15–20 см3 воздуха и определяли его местонахождение в роге, извлекал стилет и присоединяли систему для извлечения эмбрионов. Проводили вымывание эмбрионов специально приготовленной средой. Для этого рог матки поднимали за верхушку, осторожно оттягивали вдоль брюшной полости и слегка массировали. В этот период промывная среда через отверстие в катетере поступает внутрь его и самотеком попадает в стерильный цилиндр для сбора жидкости. Эту процедуру выполняли 8–10 раз. Обычно на промывание одного рога

37