5. Манипулирование с эмбрионами вне организма

Извлеченные эмбрионы необходимо сохранить жизнеспособными в период между извлечением и пересадкой. С этой целью жидкость, полученную после промывания рогов матки, ставят в термостат и отстаивают 15–20 мин при температуре 37 °С. Затем отделяют нижнюю часть смыва и переносят в чашку Петри, круглодонную чашку или на часовое стекло и тщательно просматривают под малым увеличением микроскопа (×25). Эти манипуляции можно проводить при комнатной температуре в стерильной комнате или в специальном настольном боксе.

Обнаруженные эмбрионы вылавливают пипеткой, помещают в питательную среду и хранят в термостате при 37 °С. В качестве питательной среды используют фосфатный солевой раствор Дюльбекко с 20 % эмбриональной сыворотки или физиологическую среду 199 на буфере Хенкса также с добавлением эмбриональной сыворотки. Вместо эмбриональной сыворотки можно добавить бычий сывороточный альбумин из расчета 4 мг/мл или сыворотку крови телят 6–10-месячного возраста. Сыворотку крови необходимо инактивировать прогреванием при 56 °С в течение 30 мин. В питательной среде поддерживают рН в пределах 7,2–7,6 и осмотическое давление 270–310 мосмолей. Большинство питательных сред, содержащих бикарбонатно-ионную буферную систему, поддерживают необходимый рН путем добавления к атмосфере воздуха 5 % СО2. Если объем газа во флаконе или пробирке сравнительно небольшой по отношению к объему среды, то осмотическое давление и рН можно поддерживать длительное время путем герметизации этих емкостей. Если среда находится в открытых сосудах, то в окружающей атмосфере необходимо поддерживать 5 %-е содержание СО2 путем периодического введения газовой смеси, содержащей СО2. Среды на буфере Хенкса, а также раствор Дюльбекко не меняют быстро рН и в отсутствие СО2. Влажность в термостате, где хранятся эмбрионы, поддерживают около 100 %, чтобы исключить испарение среды и последующее увеличение осмотического давления. Если эмбрионы хранятся до пересадки более 2 ч, то их следует помещать в свежую среду через каждые 2 ч.

26

Оценка качества эмбрионов

Оценка жизнеспособности эмбрионов ведется в трех основных направлениях:

1)поиск возможных взаимосвязей между морфологическими показателями (такими как соответствие стадии развития возрасту зародыша, выраженность эмбриобласта и трофобласта и приживляемостью эмбрионов;

2)изучение некоторых обменных процессов в эмбрионах, которые позволили бы оценить их жизнеспособность;

3)выяснение адсорбционных свойств оболочек и цитоплазмы бластомеров к различным красителям.

При оценке качества эмбрионов прежде всего обращают внимание на то, чтобы по стадии развития они соответствовали времени извлечения. Эмбрионы крупного рогатого скота 8-дневного возраста обычно находятся на стадии ранней бластоцисты. Отличительной особенностью эмбрионов 8-дневного возраста по сравнению с эмбрионами более ранних стадий (6–7-дневных) является наличие бластоцеля и четко выраженных трофобласта и эмбриобласта. 10-днев- ные эмбрионы находятся на стадии поздней бластоцисты, характеризующейся отсутствием прозрачной оболочки и более крупным размером. Они примерно в 1,5–2,0 раза крупнее, чем 8-дневные эмбрионы. Нормальные эмбрионы компактны, сферической формы; бластомеры одинакового размера и имеют хорошо различимые клеточные мембраны. Неполноценные эмбрионы содержат бластомеры различных размеров, неразличимые клеточные мембраны и другие признаки дегенерации.

Морфологические отклонения в структуре эмбрионов, однако, не всегда являются критерием их нежизнеспособности. В одном из исследований более 50 % эмбрионов, полученных от овец-доноров через 2–3 дня после охоты, были классифицированы как имеющие морфологические нарушения. Большинство из них содержали одну или более безъядерных клеток различного размера одновременно

снормальными бластомерами. Однако этот тип морфологических отклонений не оказал заметного влияния на последующее развитие при пересадке их реципиенту. Авторы заключили, что большинство так называемых анормальных эмбрионов было бы более правильно классифицировать как нетипичные. В связи с этим большое

27

внимание исследователей направлено на разработку более объективных тестов определения жизнеспособности зародышей.

Биохимическая оценка жизнедеятельности эмбриона, основанная на изучении обменных процессов, ввиду малого размера объекта исследования требует длительного времени для накопления необходимого количества продуктов обмена, достаточного для определения биохимическими методами. Чтобы установить степень различия в содержании глюкозы в культуральной среде до и после инкубирования эмбрионов, требуется не менее 20 ч. При длительном культивировании понижается жизнеспособность эмбрионов, что приводит

кнецелесообразности применения таких методов оценки качества эмбрионов.

Наиболее перспективными, по-видимому, должны стать гистохимические методы оценки жизнеспособности эмбрионов, основанные на специфических реакциях различных структурных элементов и веществ клеток к витальным и флюоресцентным красителям. Эти реакции, в отличие от биохимических методов, протекают очень быстро, и для их осуществления требуется минимальное количество веществ, вступающих в реакцию.

Кардимович предложила оценивать жизнеспособность овечьих эмбрионов окрашиванием нейтральным красным в течение 2 ч. Однако было показано, что нейтральный красный хотя и относится

кдиазиновым соединениям, но он способен окрашивать и живые клетки. Для более четкого отличия живых эмбрионов от мертвых предлагают выдерживать эмбрионы с этим красителем в течение 2 ч, хотя столь длительный период значительно понижает ценность метода. Предложен также метод отличия живых эмбрионов от мертвых, основанный на эффекте флюоресценции диацетата с гидролазами, которые присутствуют только в живых клетках. Этот метод довольно быстрый, но требует специального микроскопа и специальных условий для работы.

Хранение эмбрионов

Разработка методов хранения эмбрионов вне организма значительно облегчает широкое применение метода трансплантации в разведении животных. Кратковременное хранение эмбрионов при плюсовых температурах, от нескольких часов до нескольких суток,

28

дает возможность транспортировать их на другие фермы, даже в другие страны. Длительное хранение в замороженном состоянии открывает возможность транспортировки эмбрионов в любую точку земного шара, исключает необходимость содержания дополнительного количества реципиентов и позволяет создавать банки генетического материала от высокоценных животных и исчезающих видов.

Одним из примеров хранения эмбрионов может быть пересадка их в яйцевод животного другого вида. Очень удобным объектом такого рода является кролик. Было показано, что в яйцеводах кролика могут успешно продолжать развитие до 5–6 сут. эмбрионы крупного рогатого скота, овцы, свиньи, лошади, мыши и хорька. Причем они могут развиваться нормально только до времени вылупления из зоны пеллюцида или имплантации. Эмбрионы крупного рогатого скота, хранившиеся в яйцеводе кролика в течение 3–4 сут., имели выживаемость 73 % после пересадки их реципиентам. Половой тракт кролика был использован для длительной транспортировки эмбрионов овец и лошадей.

Эмбрионы многих видов животных могут продолжать развитие до 5–6 сут. при температуре тела в специальных физиологических средах и в оптимальных атмосферных условиях, но их жизнеспособность обычно резко понижается через 2–3 сут.

В определенной степени выживаемость эмбрионов может быть увеличена путем охлаждения их ниже температуры тела. Чувствительность эмбрионов к охлаждению в значительной степени зависит от вида животного. Эмбрионы свиней являются особенно чувствительными к охлаждению. Пока не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на разных стадиях развития после медленного или быстрого охлаждения их до температуры ниже 10–15 °С. Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития (8–16 бластомеров) также очень чувствительны к охлаждению, и лишь единичные из них выживают после охлаждения до 0 °С. Однако на более поздних стадиях развития, таких как морула или бластоциста, они хорошо выдерживают охлаждение. Эмбрионы овец хорошо переносят охлаждение до 0 °С на любых стадиях развития, от 1–2 клеток до бластоцисты.

Понижение температуры хранения эмбрионов от 37 °С до 10 и 0 °С угнетает или останавливает их развитие, но обменные

29

процессы протекают на уровне, обеспечивающем хранение обычно не более 5–6 сут. Для длительного хранения эмбрионов необходимо затормозить не только их развитие, но и значительно снизить или полностью остановить обменные процессы. Такое состояние эмбрионов достигается при понижении температуры до –196 °С или ниже.

Успешное замораживание и оттаивание эмбрионов мышей было впервые достигнуто в 1971 г. Это открыло широкие возможности в направлении разработки методов хранения эмбрионов млекопитающих при низких температурах. На первом этапе эти разработки концентрировались на эмбрионах лабораторных животных. Однако с успешной разработкой в эти годы технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота и внедрением ее в практику разведения животных значительно вырос интерес исследователей к методу замораживания эмбрионов сельскохозяйственных животных, так как его применение значительно упростило бы проблему хранения и транспортировки эмбрионов. Через два года после получения потомства из замороженных эмбрионов мышей были получены телята после пересадки замороженных и оттаянных эмбрионов коровы, а затем и овцы. Техника замораживания эмбрионов крупного рогатого скота и овец в значительной степени аналогична той, которая используется для замораживания эмбрионов мышей. Основные различия между эмбрионами разных видов по технике замораживания определяются тем, на какой стадии развития они лучше сохраняют жизнеспособность после замораживания и оттаивания. Успешное замораживание эмбрионов лабораторных животных (мышь, крыса, кролик) достигается на более ранних стадиях развития, от 2–4-клеточной до морулы. Оптимальной стадией развития для замораживания эмбрионов овец являются морула и бластоциста, а для эмбрионов крупного рогатого скота – бластоциста. В настоящее время большинство исследователей предпочитают замораживать 7–8-дневные эмбрионы крупного рогатого скота.

Разрушение клеток при замораживании и оттаивании происходит под влиянием двух основных факторов: формирования кристаллов льда внутри клетки и концентрирования растворимых веществ в жидкой фазе среды, образовавшейся после вымораживания воды. Оба этих фактора могут действовать одновременно, но влияние первого более выражено при относительно быстром, а второго – при

30

относительно медленном замораживании. Для уменьшения количества образовавшегося льда внутри клетки и поддержания в ней определенной концентрации растворителей применяют криопротекторы, диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерин в концентрациях от 1 до 2 М в растворе фосфатного буфера. Добавление и удаление криопротекторов, однако, вызывает быстрое изменение осмотического давления, что может повредить эмбрионы. Поэтому необходимы определенные предосторожности при введении криопротекторов. В большинстве случаев концентрацию криопротектора в среде повышают при комнатной температуре по 0,5 М с интервалом 10 мин. Удаление криопротектора после оттаивания проводят со скоростью 0,25 М каждые 10 мин.

Впервых экспериментах на эмбрионах мышей успешное замораживание было достигнуто при относительно низкой скорости замораживания (0,3–1 °С/мин) до температуры –60 °С и последующем погружении в жидкий азот в сочетании с медленным оттаиванием (4–25 °С/мин). Аналогичная технология была использована для замораживания эмбрионов кролика. Эмбрионы извлекали хирургическим методом у крольчих породы шиншилла через 56–60 ч после спаривания. Введение ДМСО в раствор Дюльбекко проводили

вследующей последовательности: 0,25 М, 0,5 М, 1,0 М – по 10 мин и 1,5 М – 20 мин. Затем эмбрионы помещали в пробирки или ампулы с 0,3 мл 1,5 М ДМСО в физиологической среде, закрывали пробками или запаивали, замораживали со скоростью 1 °С/мин от комнатной температуры до –76 °С и переносили в жидкий азот для хранения. Кристаллизацию индуцировали при –5 °С. После 15–45-дневного хранения эмбрионы оттаивали со скоростью 4 °С/мин до 0 °С, а затем переносили ампулы в воду с температурой 37 °С. Выведение криопротектора проводили в следующей последовательности: 1,25 М, 1,0 М, 0,75 М, 0,5 М и 0,25 М по 10 мин и затем эмбрионы переносили в раствор Дюльбекко с 20 %-й сывороткой крови плода на 20 мин.

Вэкспериментах на эмбрионах овец и крупного рогатого скота требование медленного оттаивания эмбрионов было поставлено под сомнение. Установлено, что медленное оттаивание эмбрионов необходимо только в том случае, если медленное замораживание проводится до очень низких температур, тогда как быстрое оттаивание

31