Билет 3

1)Физ-хим свойства и методы фракционирования белков

Физико-химические свойства и методы фракционирования белков.

Денатурация - любое негидролитическое изменение структуры белка, проводящее к изменению его биолог. и физико-хим. св-тв. Факторы: физ.(t, давление, УЗ); хим.(кислоты, щелочи, тяжMe); био(протеолитические ферменты).

Амфотерность- проявление молекулой белка кислотных и основных свойств).

Изоэлектр.точка-рН среды, при котором суммарный заряд белка равен 0.

Растворимость белка-способность белка образовывать с др.вещ-вами однородные системы-растворы в которых белок нах-ся в виде отдельных молекул или частиц. (Зависит от АК состава, рН среды, наличия соли).

Высаливание-растворимость белков сильно зависит от конц.солей; снижение растворимости белка при ув.конц.соли относительно той её величины, при которой растворимость белка была max.

Диализ-метод очистки белков от нозкомолек.примесей с использ.полупрониц.мембран.

Электрофорез-основан на разлив.в подвижности молекул в эл.поле(различия в заряде).

Хроматография-метод разделения смесей в-тв или частиц, основанный на различиях в скоростях или перемещ. в системе несмеш. и движ. относительно друг друга фаз.

2)Гликолиз

Гликолиз – это последовательность ферментативных реакций, приводящих к превращению глюкозы в пируват с одновременным образованием АТФ.

При аэробных условиях пируват проникает в митохондрии, где полностью окисляется до СО2 и Н2О. Если содержание кислорода недостаточно пируват превращается в лактат.

Анаэробный гликолиз – сложный ферментативный процесс распада глюкозы, протекающий в тканях человека и животных без потребления кислорода. Конечным продуктом-молочная кислота. В процессе гликолиза образуется АТФ.

В анаэробных условиях гликолиз – единственный процесс в животном организме, поставляющий энергию. Процесс гликолиза катализируется 11 ферментами, протекает в цитоплазме клетки. На первых стадиях гликолиза затрачиваются 2 молекулы АТФ (гексокиназная и фосфофруктокиназная реакции) на последующих образуются 4 молекулы АТФ (фосфоглицераткиназная и пируваткиназная реакции). Таким образом, энергетическая эффективность гликолиза составляет 2 молекулы АТФ на одну молекулу глюкозы.

Первой ферментативной реакцией гликолиза является фосфорилирование, т.е. перенос остатка ортофосфатана глюкозу за счет АТФ. Реакция катализируется ферментом гексокиназой.

Образование глюкозо-6-фосфата в гексокиназной реакции сопровождается освобождением значительного количества свободной энергии системы и может считаться практически необратимым процессом.

Наиболее важным свойством гексокиназы является ее ингибирование глюкозо-6-фосфатом, т.е. последний служит одновременно и продуктом реакции, и аллостерическим ингибитором.

Второй реакцией гликолиза является превращение глюкозо-6-фос-фата под действием фермента глюкозо-6-фосфатизомеразы во фруктозо-6-фосфат.

Эта реакция протекает легко в обоих направлениях, и для нее не требуется каких-либо кофакторов.

Третья реакция катализируется ферментом фосфофруктокиназой; образовавшийся фруктозо-6-фосфат вновь фосфорилируется за счет второй молекулы АТФ.

Данная реакция практически необратима, протекает в присутствии ионов магния и является наиболее медленно текущей реакцией гликолиза. Фактически эта реакция определяет скорость гликолиза в целом.

Фосфофруктокиназа относится к числу аллостерических ферментов. Она ингибируется АТФ и стимулируется АМФ . При значительных величинах отношения АТФ/АМФ активность фосфофруктокиназы угнетается и гликолиз замедляется.

Четвертую реакцию гликолиза катализирует фермент альдолаза. Под влиянием этого фермента фруктозо-1,6-бисфосфат расщепляется на две фосфотриозы.

Эта реакция обратима.

Пятая реакция – это реакция изомеризации триозофосфатов. Катализируется ферментомтриозофосфатизомеразой.

Образованием глицеральдегид-3-фосфата завершается первая стадия гликолиза. Вторая стадия – включает окислительно-восстановительную реакцию (реакциягликолитической оксидоредукции), сопряженную с субстратным фосфорилированием, в процессе которого образуется АТФ.

В результате шестой реакции глицеральдегид-3-фосфат в присутствии фермента глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, кофермента НАД и неорганического фосфата подвергается своеобразному окислению с образованием 1,3-бисфосфоглицериновой кислоты и восстановленной формы НАД (НАДН).

Седьмая реакция катализируется фосфоглицераткиназой, при этом происходит передача богатого энергией фосфатного остатка (фосфатной группы в положении 1) на АДФ с образованием АТФ и 3-фосфогли-цериновой кислоты (3-фосфоглицерат).

Таким образом, благодаря действию двух ферментов (глицеральде-гидфосфатдегидрогеназы и фосфоглицераткиназы) энергия, высвобождающаяся при окислении альдегидной группы глицеральдегид-3-фосфата до карбоксильной группы, запасается в форме энергии АТФ. В отличие от окислительного фосфорилирования образование АТФ из высокоэнергетических соединений называется субстратным фосфорилированием.

Восьмая реакция сопровождается внутримолекулярным переносом оставшейся фосфатной группы, и 3-фосфоглицериновая кислота превращается в 2-фосфоглицериновую кислоту (2-фосфоглицерат).

Реакция легкообратима, протекает в присутствии ионов Mg2+. Кофактором фермента является также 2,3-бисфосфоглицериновая кислота.

Девятая реакция катализируется ферментом енолазой, при этом 2-фосфоглицериновая кислота в результате отщепления молекулы воды переходит в фосфоенолпировиноградную кислоту (фосфоенолпируват), а фосфатная связь в положении 2 становится высокоэргической.

Енолаза активируется двухвалентными катионами Mg2+или Мn2+ и ингибируется фторидом.

Десятая реакция характеризуется разрывом высокоэргической связи и переносом фосфатного остатка от фосфоенолпирувата на АДФ (субстратное фосфорилирование). Катализируется ферментом пируваткиназой.

Для действия пируваткиназы необходимы ионы Mg2+, а также одновалентные катионы щелочных металлов(К+ или др.). Внутри клетки реакция является практически необратимой.

В результате одиннадцатой реакции происходит восстановление пировиноградной кислоты и образуется молочная кислота. Реакция протекает при участии фермента лактатдегидрогеназы и кофермента НАДН, образовавшегося в шестой реакции.

Реакция восстановления пирувата завершает внутренний окислительно-восстановительный цикл гликолиза. НАД+ при этом играет роль промежуточного переносчика водорода от глицеральдегид-3-фосфата (6-я реакция) на пировиноградную кислоту (11-я реакция), при этом сам он регенерируется и вновь может участвовать в циклическом процессе, получившем название гликолитический оксидоредукции.

Биологическое значение процесса гликолиза заключается прежде всего в образовании богатых энергией фосфорных соединений. На первых стадиях гликолиза затрачиваются 2 молекулы АТФ (гексокиназная и фосфофрук-токиназная реакции). На последующих образуются 4 молекулы АТФ (фосфоглицераткиназная и пируваткиназная реакции). Таким образом, энергетическая эффективность гликолиза в анаэробных условиях составляет 2 молекулы АТФ на одну молекулу глюкозы.

Как отмечалось, основной реакцией, лимитирующей скорость гликолиза, является фосфофруктокиназная. Вторая реакция, лимитирующая скорость и регулирующая гликолиз – гексокиназная реакция. Кроме того, контроль гликолиза осуществляется также ЛДГ и ее изоферментами.

В тканях с аэробным метаболизмом (ткани сердца, почек и др.) преобладают изоферменты ЛДГ1 и ЛДГ2 (см. главу 4). Эти изоферменты ингибируются даже небольшими концентрациями пирувата, что препятствует образованию молочной кислоты и способствует более полному окислению пирувата (точнее, ацетил-КоА) в цикле трикарбоновых кислот)

3)Система фибринолиза.

Система фибринолиза

Это ферментная система, действие которой заключается в деградации (лизисе) фибрина, реканализации сосудов и восстановлении кровотока. Она препятствует образованию диссеминированного тромбоза и активизируется одновременно с системой свёртывания и системой антикоагулянтов.

Основные компоненты:

1. Плазминоген, преобразующийся при активации в плазмин.

2. Активаторы плазминогена:

- фактор XIIа в комплексе с плазменным калликреином (КК) и высокомолекулярным кининогеном (ВМК);

- тканевый плазминогеновый активатор (ТПА, t-РА), вырабатывающися в эндотелии; среди подобных ему можно назвать урокиназу (u-РА), продуцируемую различными тканями.

Активаторы плазминогена содержатся в том числе во всех форменных элементах крови, откуда освобождаются при их разрушении.

3. Ингибиторы фибринолиза:

- PAI-1 (plasminogen activator inhibitor – 1);

- PAI-II;

- α2-антиплазмин;

- α2-макроглобулин

- α1-антитрипсин

Активация по внешнему пути осуществляется за счёт ТПА, поступаюшего из эндотелия сосудов. Связываясь на поверхности фибрина, или внутри сгустка образуется тройной комплекс (плазминоген-фибрин-ТПА). Урокиназа, в отличие от ТПА, не связывается с фибрином, но фиксируется на поверхности различных клеток, имеющих рецепторы для плазминогена, что ведёт к образованию активного плазмина на эндотелии и различных форменных элементах крови, участвующих в формировании тромба.

Внутренний путь активации фибринолиза аналогичен внутреннему пути в системе свёртывания, то есть, это контактная поверхность, приводящая к образованию фактора XIIa и калликреина. И тот и другой факторы переводят плазминоген в плазмин. Последний в свою очередь по механизму положительной обратной связи ускоряет активацию фактора Хагемана и прекалликреина, что приводит к значительному ускорению как самого фибринолиза, так и системы свёртывания. Таким образом поддерживается необходимый баланс между образованием и лизисом фибрина.

Как правило, образование плазмина из плазминогена происходит внутри фибринового сгустка.

Фибринолиз ингибируется соединениями, которые связывают плазмин или тормозят активацию плазминогена. Основным ингибитором плазмина является PAI-1, он постоянно продуцируется и секретируется эндотелиоцитами, инактивирует как тканевой, так и урокиназный активаторы плазминогена. Другой не менее важный ингибитор – α2-антиплазмин. Он синтезируется в печени и способен соединяться как с плазмином, так и необратимо с фибрином, что обусловлено наличием фактора XIIIа. Разрушая плазмин, находящийся в кровотоке, α2-антиплазмин способствует тому, что в физиологических условиях в плазме свободный плазмин практически не встречается. Плазмин, связанный с α2-антиплазмином, теряет способность разрушать фибрин, а фибрин, связавшись с этим ингибитором, становится весьма устойчивым к действию фибринолитических агентов. Плазмин, который уже связан с фибрином, инактивируется α2-макроглобулином.Действие его несколько слабее и медленнее чем предыдущего, но α2-макроглобулин нейтрализует плазмин, если он не может быть связан с α2-антиплазмином. К ингибиторам фибринолиза относятся также α1-антитрипсин, α1-химотрипсин, интер-1α-трипсин, антитромбин-III, интер-α-глобулин, ингибитор фактора Хагемана и др.