Александров Ю.И., Анохин К.В. - Нейрон. Обработка сигналов. Пластичность. Моделирование_ Фундаментальное руководство (2008)

12.2.1.7. Каналы, управляемые цГМФ

Гидролиз цГМФ, вызываемый фосфодиэстеразой, снижает концентрацию цГМФ внутри клетки и приводит к закрыванию каналов, управляемых цГМФ. В темноте фоновая концентрация (несколько мкМ) цГМФ обеспечивает открытое состояние у небольшого процента каналов. Включение света снижает концентрацию цГМФ и приводит к быстому закрыванию каналов с субмиллисекундной задержкой (Karpen е.а., 1998). Эффективность взаимодействия цГМФ с каналом увеличи- вается при снижении концентрации Са2+ в клетке (Nakatani е.а., 1995).

Каналы, управляемые цГМФ, относятся к семейству неспецифи- ческих катионных каналов, управляемых циклическими нуклеотидами (cyclicnucleotide-gated — CNG— channels) (Kaupp, Seifert, 2002). Они расположены на плазматической мембране наружного сегмента фоторецептора и являются последним компонентом фототрансдукции. Каналы, управляемые циклическими нуклеотидами, состоят из четырех субъединиц, относящихся к двум различным типам А (или α) и В (или β) (CNGА и CNGВ = CNGб и CNGв). Субъединицы А-типа способны к формированию гомомерного функционального канала, тогда как субъединицы В-типа образуют канал только при одновременной экспрессии с субъединицами А-типа. Субъединицы обоих типов имеют изоформы (Kaupp, Seifert, 2002).

В цГМФ-управляемых каналах палочек и колбочек соотношение субъединиц А- и В-типов неодинаково, при этом однотипные субъединицы представлены различными изоформами. Композиционный состав каналов у палочек 3CNGA1:1CNGB1 (Zhong е.а., 2002), а у колбо- чек — 2CNGA3:2CNGB3 (Peng е.а., 2004). Мутации, приводящие к изменению CNGA1 субъединицы в палочках человека, вызывают пигментозный ретинит (Dryja е.а., 1995), а мутационные изменения у CNGA3 либо CNGB3 субъединиц в колбочках приводят к ахроматопсии (Kohl е.а., 1998; Kohl е.а., 2000).

Закрывание цГМФ-управляемых каналов, вызванное снижением внутриклеточной концентрации цГМФ, заканчивается в результате прекращения каталитической активности фосфодиэстеразы цГМФ.

12.2.1.8. Инактивация фосфодиэстеразы

Происходит тогда, когда с участием белков, активирующих ГТФазную активность трансдуцина, ГТФ, связанный с альфа-субъедини- цей трансдуцина, гидролизуется до ГДФ. В результате этого G-белок переходит в неактивную форму: альфа-субъединицы трансдуцина от-

310

деляются от γ-субъединиц фосфодиэстеразы и формируют исходный гетеротример, воссоединяясь с βγ-субъединицами трансдуцина. Гаммасубъединицы фосфодиэстеразы, в свою очередь, восстанавливают ингибирующие влияния на α- и β- каталитические субъединицы, инактивируя, таким образом, фосфодиэстеразу цГМФ.

Мало что известно о факторах, активирующих белки, усиливающие ГТФ-азную активность трансдуцина. Есть данные о том, что одним из таких факторов являются некаталитические (γ-субъединицы) фосфодиэстеразы (Angleson,Wensel, 1994). Однако данные более поздних исследований свидетельствуют о том, что г-субъединицы фосфодиестеразы спосбны усиливать ГТФ-азной активности трансдуцина без участия белков GAP комплекса (Tsang е.а.,2006).

Инактивация фосфодиэстеразы предотвращает дальнейшее снижение уровня цГМФ в клетке, но не предполагает восстановление концентрации этого вещества до темнового уровня.

12.2.1.9. Восстановление концентрации цГМФ обеспечивают гуа- нилат-циклазы (GC), присутствующие как в палочках, так и в колбоч- ках. В фоторецепторах выявлены два типа циклаз — GC1 (GC-E) è GC2 (GC-F). Циклазы обоих типов могут быть в одной клетке, однако GC-1, доминирующая в колбочках, выявлена и в палочках, а GC2 — только в палочках (Shyjan e.a., 1992; Lowe e.a., 1995).

Особенностью циклаз, представленных в фоторецепторах, является их зависимость от концентрации катионов кальция внутри клетки, проявляющаяся в увеличении активности фермента при снижении уровня внутриклеточного кальция (Lolley, Racz, 1982; Koch, Stryer, 1988).

Âнастоящее время известно, что активность гуанилат-циклаз в фоторецепторах регулируют низкомолекулярные белки, относящиеся к семейству кальций-связывающих белков, включающему кальмодулин. Эти белки, активирующие гуанилат циклазу, получили название GCAP (GCAPs — guanylyl-cyclase activating proteins).

Âсетчатке млекопитающих выявлены два типа таких белков — GCAP1

èGCAP2. Данные, полученные на ноккаутных животных, свидетельствуют об одинаковой эффективности GCAP2 для активации обоих типов гуанилат-циклаз — GC1 и GC2, тогда как GCAP1 активирует преимущественно GC1 (Mendez е.а., 2001). Экспрессия GCAP1 и GCAP2 в палочках и колбочках не одинакова, но соответствует типу циклаз, представленных в фоторецепторе. Так, в палочках, имеющих оба типа циклаз (GC1 и GC2), выявлены оба типа белков (GCAP1 и GCAP2), а в колбоч-

311

ках, содержащих преимущественно один тип циклазы (GC1), преобладает один тип белка (GCAP1) (Cuenca e.a., 1998; Kachi e.a., 1999).

В темноте относительно высокая концентрация кальция обеспечи- вает существование GCAP в Са2+-связанной форме. Отделение кальция от GCAP при уменьшении концентрации этого катиона (во время ответа на свет) позволяет белку активировать гуанилат-циклазу (Mendez е.а., 2001). Активация гуанилат-циклазы, обусловленная измененим концентрации внутриклеточного кальция и вызываемая GCAP, возникает раньше (в течение 40мс), чем начинается фосфориллирование пигмента (через 80-100 мс после вспышки света) (Burns e.a., 2002). Полагают, что такая быстрота обратной связи, регулирующей гуани- лат-циклазу, обеспечивает в фоторецепторе два эффекта: повышение чувствительности к вспышкам света при темновой адаптации и ускоренное восстановление темнового тока, обусловленного цГМФ-управ- ляемыми каналами (Mendez е.а., 2001).

Белок, способный связывать кальций и модулировать активность гуанилат-циклазы, выявлен также в сетчатке низших позвоночных. В отличие от GCAP млекопитающих, этот белок (GCIP — guanylatecyclase inhibitory protein) не стимулирует гуанилат циклазу при снижении внутриклеточного кальция, но способен угнетать ее активность при повышении концентрации кальция внутри клетки. (Li e.a., 1998).

Изменения внутриклеточной концентрации кальция, вызывающие усиление либо угнетение фототрансдукции на различных этапах, свидетельствуют о несомненном участии этого катиона в обеспечении способности фоторецептора отвечать на световой стимул как в темноте, так и при различных условиях световой адаптации. При отсутствии изменений внутриклеточного кальция фоторецептор суммирует реакции, вызванные отдельными фотонами, до тех пор, пока все цГМФуправляемые каналы не закроются, то есть до полного насыщения фоторецептора (Fain e.a., 2001).

Однако очевидно, что процесс световой адаптации фоторецептора не может определяться исключительно кальций-зависимыми механизмами. Одним из таких механизмов, не связанных с кальцием, является, видимо, модуляция гидролиза ГТФ, связанного с альфа-субъедини- цей трансдуцина (Woodruff e.a., 2008). Так, известно, что переход от темновой адаптации к световой вызывает, в частности, ускорение спада светового ответа как у колбочек (Soo e.a., 2008), так и у палочек (Woodruff e.a., 2008). Ускоренное восстановление фоторецептора, наблюдающееся в этих условиях, связывают с увеличением скорости

312

инактивации каскада фототрансдукции (Soo e.a., 2008; Woodruff e.a., 2008). Отсутствие у мышей с точечными мутациями в гамма-субъеди- ницах фосфодиэстеразы цГМФ ускорения спада светового ответа палочки, вызываемого световым фоном, свидетельствует о том, что модуляция скорости инактивации каскада фототрансдукции может осуществляться за счет изменения активирующих влияний гамма-субъединиц фосфодиэстеразы цГМФ на ГТФ-азную активность трансдуцина (Woodruff e.a., 2008).

12.2.2. Выделение медиатора синаптическими терминалями фоторецепторов

Результатом биохимических реакций, возникающих при захвате квантов света молекулами зрительного пигмента и приводящих к изменению мембранного потенциала фоторецептора, является передача сигнала последующим клеткам сетчатки с помощью медиатора, выделяемого синаптическими терминалями.

Везикулярное выделение медиатора в синапсах, образованных обыч- ными нейронами, начинается с локального повышения концентрации внутриклеточного кальция, обусловленного входом этого катиона в синаптическую терминаль при ее деполяризации во время генерации потенциала действия. Фоторецепторы, с одной стороны, не генерируют спайк, то есть лишены такого механизма роста внутриклеточного кальция, а с другой стороны, они обладают ленточными синапсами, нуждающимися в кальции значительно больше, чем синапсы обычные. Повышенная «потребность» в кальции усугубляется еще и постоянным выделением медиатора в темноте (рис. 12.8).

12.2.2.1. Кальций в синаптических терминалях фоторецепторов

Решающую роль в обеспечении необходимой концентрации кальция в синаптической терминали фоторецептора играют кальциевые каналы, выявленные, в частности, рядом с ленточными синапсами в фоторецепторах млекопитающих (Morgans, 2001). Вход кальция в синаптические терминали фоторецепторов позвоночных животных обеспечивают потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа (Corey e.a., 1984; Morgans, 2001).

Кальциевые каналы в фоторецепторах млекопитающих отличаются от аналогичных каналов низших позвоночных животных более сложной молекулярной структурой и диапазоном мембранного потенциала, вызывающего активацию канала. Так, половина от максимальной прово-

313

димости канала у низших позвоночных наблюдается при мембранном потенциале -13 — -31 мВ, а у млекопитающих — при -40 — -50 мВ (см. обзор Schwartz, 2002).

Ðèñ. 12.8. «Темновой» ток в фоторецепторе (палочке) сетчатки позвоноч- ных. (А) В темноте Na+ через катионные каналы проходит в наружный сегмент палочек, вызывая деполяризацию. Петля тока проходит через перешеек палоч- ки за счет того, что К+-ток течет наружу из мембраны внутреннего сегмента.

(Б) При освещении наружного сегмента каналы закрываются из-за уменьшения внутриклеточной концентрации цГМФ, и палочка гиперполяризуется. Концентрации Na+, Ê+ è Ñà2+ поддерживаются внутри палочки специальными насосами и ионообменниками, расположенными в области внутреннего сегмента (темные кружки) (по А. В. Латанову).

314

В фоторецепторах низших позвоночных есть второй путь поступления кальция в клетку, отсутствующий у млекопитающих. Дополнительный вход кальция в клетку осуществляется у этих животных че- рез локализованные на соме и синаптических терминалях фоторецепторов (Savchenko е.а., 1997) катионные каналы, управляемые цГМФ (Rieke, Schwartz, 1994). Независимость этих каналов от мембранного потенциала обеспечивает постоянный уровень внутриклеточного кальция, необходимый для выделения синаптических везикул (Schwartz, 2002).

Работу ленточного синапса обеспечивают не только кальциевые каналы, но и такие «переносчики» кальция, как натрий-кальциевый обменник (Na+-Ca2+ обменника — NCX) и кальциевая АТФ-аза (Са2+- АТФ-аза — РМСА), расположенные на мембранах синаптических терминалей фоторецепторов совместно с многочисленными рибосомами (Johnson e.a, 2007). При этом натрий-кальциевый обменник обнаружен только в синаптических терминалях колбочек, а кальциевая АТФаза выявлена у обоих типов фоторецепторов.

Полагают, что наличие быстрого высокочувствительного обменника в колбочках обеспечивает более высокую, по сравнению с палочками, концентрацию кальция в синаптической терминали и определяет как относительно быстрое выделение синаптических везикул терминалями колбочек (Sheng e.a., 2007), так и быструю кинетику ответа колбочек при световой адаптации (Johnson e.a, 2007).

12.2.2.2. Модуляция выделения медиатора

Уровень деполяризации синаптических терминалей, определяющий количество выделяемого медиатора, является результатом взаимодействия фототока, возникшего в наружном сегменте, с токами, обусловленными ионными каналами, локализованными на соме и/или на синаптических терминалях фоторецептора.

На синаптических терминалях фоторецепторов выявлены как каналы, управляемые мембранным потенциалом (потенциал-зависимые калиевые и натриевы каналы), так и каналы, управляемые рецепторами (глутамата и гамма-аминомасляной кислоты — ГАМК). Взаимодействуя с соответствующими рецепторами, внеклеточные глутамат (выделяемый фоторецепторами) и ГАМК (выделяемая горизонтальными клетками) способны регулировать количество медиатора, выделяемого фоторецепторными клетками.

315

12.2.2.3. Метаботропные рецепторы глутамата (mGluRIII)

Метаботропные рецепторы mGluRIII-типа, расположенные на синаптических терминалях фоторецепторов, являются одной из мишеней для внеклеточного глутамата.

У низших позвоночных животных метаботропные рецепторы глутамата функционально идентифицированы только на синаптических терминалях колбочек (Hirasawa e.a., 2002; Hosoi e.a., 2005). У млекопитающих рецепторы этого типа иммуногистохимическими методами выявлены в сетчатке грызунов на синаптических терминалях у обоих типов фоторецепторов (Koulen e.a., 1999; Koulen, Brandstätter, 2002), а у кошек обнаружены только на сферулах палочек (Cai, Pourcho, 1999). Почти во всех синаптических терминалях палочек и у части (25%) терминалей колбочек метаботропные рецепторы глутамата (mGluR8) обнаружены рядом с ленточными синапсами (Koulen, Brandstätter, 2002).

Как у млекопитающих (Koulen e.a., 1999), так и у низших позвоноч- ных (Hirasawa e.a., 2002; Hosoi e.a., 2005) взаимодействие этих рецепторов с глутаматом приводит к угнетению выделения медиатора фоторецепторами.

Возможны два механизма угнетения выброса медиатора опосредованного метаботропными рецепторами глутамата — за счет подавления входа кальция в клетку или за счет гиперполяризации мембраны синаптической терминали. Подавление проводимости кальциевых каналов при активация глутаматом метаботропных рецепторов mGluRIII-типа происходит путем прямого взаимодействия βγ-субъединиц, связанного с рецептором G-белка, с белковыми субъединицами кальциевого канала (Takahashi et al., 1996; Dolphin, 1998; Dolphin, 2003), тогда как гиперполяризация синаптической терминали возникает за счет увеличения проводимости калиевых каналов через внутриклеточные пути, связанные с цАМФ (Cartmell, Schoepp, 2000).

Полагают, что эффект, вызываемый mGluRIII-рецепторами в фоторецепторных клетках, обусловлен, скорее всего, подавлением проводимости кальциевых каналов, поскольку угнетение выделения медиатора синаптическими терминалями фоторецептора сопровождается подавлением входного тока кальция (Koulen e.a., 1999) через кальциевые каналы L-типа (Hosoi e.a., 2005).

316

12.2.2.4. Переносчики (транспортеры) глутамата

Глутамат, находящийся во внеклеточной среде, способен вызывать активацию не только рецепторов глутамата, но и белков-транспорте- ров — переносчиков этой аминокислоты, обеспечивающих его удаление из внеклеточной среды. Перенос глутамата, осуществляемый транспортерами, является электрогенным процессом, зависящим от внеклеточной концентрации ионов натрия и мембранного потенциала. Перенос глутамата в клетку увеличивается при деполяризации и уменьшается при гиперполяризации (Schwartz, 2002). Транспортеры, как и связанные с ними токи, нечувствительны к агонистам и антагонистам глутамата. Их блокаду вызывают дигидрокаинат (DHKA) и DL–тео-бета- гидроксиаспартат (HA) (Eliasof, Werblin, 1993).

Активация транспортеров вызывает в фоторецепторах позвоночных (Sarantis e.a., 1988; Eliasof, Werblin, 1993; Picaud e.a., 1995; Grant, Werblin, 1996 и др.) ток хлора, обладающий характеристиками транспортеров и свойствами токов, проходящих по хлорным каналам, управляемым рецепторами (Fairman e.a., 1995).

Сопряженный с транспортерами ток может модулировать выделение медиатора за счет изменения мембранного потенциала синапти- ческих терминалей фоторецептора. Так, в колбочках, имеющих в темноте мембранный потенциал более негативный, чем равновесный потенциал для ионов хлора, ток хлора, связанный с переносчиками, вызывает дополнительную деполяризацию синаптической терминали и увеличение выделения медиатора (Sarantis et al., 1988).

Благодаря высокой чувствительности (около 100 мкМ) к глутамату и слабо выраженной десенситизации (Eliasof, Werblin, 1993), перенос- чики глутамата способны реагировать на небольшие и длительные изменения внеклеточной концентрации медиатора.

Полагают, что переносчики глутамата, локализованные на синаптических терминалях фоторецепторов, модулируют синаптическую передачу, регулируя количество выделяемого глутамата, определяя, таким образом, концентрацию медиатора в синаптической щели и уровень мембранного потенциала вторичных нейронов (Yang, Wu, 1997; Gaal e.a., 1998).

Более того, по мнению Шварца, потенциал-зависимые транспортеры глутамата, расположенные на синаптических терминалях колбочек, обеспечивают у низших позвоночных животных не только модуляцию синаптической передачи, но и независимое от кальция несинаптичес-

317

кое выделение медиатора. Предполагается, что при деполяризации синаптической терминали и снижении уровня внеклеточного глутамата транспортеры могут осуществлять перенос этой аминокислоты из клетки, поскольку постоянный вход натрия в синаптическую терминаль фоторецептора через цГМФ-управляемые каналы обеспечивает внутри клетки необходимую для работы транспортеров концентрацию катионов натрия (Schwartz, 2002).

12.2.2.5. ГАМК-эргическая модуляция выделения медиатора. Выделение медиатора синаптическими терминалями фоторецепторов модулируют два типа ионотропных рецепторов ГАМК — ГАМКа- и ГАМКс-рецепторы. Оба типа рецепторов при взаимодействии с ГАМК увеличивают проводимость хлорных каналов, но обладают различными фармакологическими и функциональными характеристиками.

Иммуногистохимическими методами ГАМКа- и ГАМКс-рецепто- ры идентифицированы почти исключительно на синаптических терминалях колбочек как у млекопитающих (в сетчатке кроликов — Greeferath e.a.,1994; Mitchel e.a.,1999, кошек — Vardi e.a., 1992, свиней — Picaud e.a., 1998; Pattnaike.a., 2000), так и у низших позвоноч- ных (Wang e.a., 2000). Исключением являются данные, полученные на сетчатке золотой рыбки, где ГАМКа-рецепторы выявлены на соме и синаптических терминалях как колбочек, так и палочек (Yazulla, Studholme, 1997).

В колбочках (черепах — Kaneko, Tachibana, 1986; свиней — Picaud e.a., 1998; крыс и мышей — Pattnaike.a., 2000) активация ГАМКарецепторов вызывает чувствительные к бикукуллину (селективному антагонисту ГАМКа-рецепторов) быстрые входные токи хлора с быстрой десенситизацией. Таким образом, ГАМКа-рецепторы обеспечивают быструю и кратковременную гиперполяризацию мембраны при внезапном повышении внеклеточной концентрации ГАМК.

Для активации ГАМКс-рецепторов требуется более низкая концентрация ГАМК, чем для активации ГАМКа-рецепторов. Нечувствительные к бикукуллину хлорные токи, обусловленные ГАМКс-рецептора- ми, развиваются медленно, обладают большим динамическим диапазоном и слабой способностью к десенситизации (Pan, Lipton, 1995; Picaud e.a., 1998; Pattnaike.a., 2000). Рецепторы этого типа обеспечивают, видимо, длительную гиперполяризацию мембраны, обусловленную постоянным присутствием во внеклеточной среде некоторого количества ГАМК.

318

12.2.2.6. Калиевые каналы

На синаптических терминалях палочек в области ленточных синапсов вместе с Са2+ каналами представлены калиевые каналы с большой проводимостью, активируемые кальцием (Barnes, Hille, 1989). В обыч- ных нейронах каналы этого типа участвуют в реполяризации мембраны после спайка. Активация калиевых каналов, вызываемая деполяризацией мембраны и входом кальция в клетку, приводит к гиперполяризации мембраны, обусловленной выходом калия из клетки, и, следовательно, к уменьшению проводимости потенциал-зависимых кальциевых каналов

èугнетению выделения медиатора.

Âфоторецепторах функция этих каналов не однозначна. Так, в палоч- ках активация этих каналов усиливает выделение медиатора за счет локальной деполяризации синаптической терминали и увеличения входного тока кальция (Xu, Slaughter, 2005). Необычный эффект объясняют тем, что выход калия из клетки через кальций-зависимые калиевые каналы вызывает в синаптической щели локальное повышение концентрации этого катиона, приводящее к деполяризации синаптической терминали. Такая своего рода «калиевая деполяризации» возникает благодаря геометрии инвагинированного синапса, обеспечивающей возможность локального повышения концентрации внеклеточного калия. Полагают, что в палочках позитивная связь кальциевых каналов и активируемых кальцием калиевых каналов лежит в основе нелинейного усиления сигнала и обеспечивает максимальное усиление небольшой гиперполяризации, вызываемой слабым светом в деполяризованном фоторецепторе (Xu e.a., 2005).

Кроме того, этот тип калиевых каналов предотвращает возникновение в фоторецепторах кальциевых спайков. Так, в палочках саламандры деполяризация мембраны, возникающая при выключении яркого света, вызывает лавинообразный вход кальция через кальциевые каналы L-типа и генерацию кальциевого спайка. Выходной ток катионов калия (через кальций-зависимые калиевые каналы с большой проводимостью), возникающий при деполяризации, гиперполяризует мембрану, предотвращая, таким образом, генерацию кальциевых спайков — как спонтанных, так и вызванных выключением света (Xu е.а., 2005).

Другой тип калиевых каналов (с аномальным выпрямлением) предотвращает возникновение в фоторецепторах натриевых потенциалов действия. Так, иммуногистохимические исследования последних лет свидетельствуют о том, что фоторецепторы млекопитающих имеют потенциал-зависимые натриевые каналы (Mojumder е.а., 2007). Более того, сначала в палочках (Kawai е.а., 2001), а потом и в колбочках

319