Александров Ю.И., Анохин К.В. - Нейрон. Обработка сигналов. Пластичность. Моделирование_ Фундаментальное руководство (2008)
.pdfжили, что нейроны холодовой чувствительности, по-видимому, управляются через синаптические входы. В работах других авторов, выполненных на различных биологических объектах, показано: холодовые нейроны тормозятся синаптически теплосензитивными нейронами, а в некоторых случаях возбуждаются температурно-нечувствительными нейронами.
Теплосензитивные нейроны демонстрируют ритмические разряды с постоянным межспайковым интервалом, а потенциалу действия предшествует медленная плавная деполяризация (рис. 13.29). Эти деполяризационные потенциалы не зависят от синаптического входа, так как ВПСП не наблюдались, когда спайковая активность подавлялась гиперполяризационным током. Наоборот, данные свидетельствуют о том, что нейронная тепловая чувствительность обеспечивается внутренними деполяризационными потенциалами, которые сходны с темпратур- но-чувствительными пейсмекерными потенциалами, описанными для других нейронов. Например, тепловая чувствительность нейронов аплизии связана с температурным влиянием на пейсмекерные потенциалы (Carpenter, 1970, 1973; Willis, Gaubatz and Carpenter, 1974), похожие деполяризационные потенциалы описаны для sunfish (Nelson and Prosser, 1981). Проведенные работы заставляют предполагать, что существует внутренний термочувствительный механизм у теплосензитивных клеток позвоночных животных. Это поддерживается и экстраклеточными исследованиями на срезах мозга крысы, в которых показано, что нейронная тепловая чувствительность сохраняется во время блокады синаптической передачи (Kelso and Boulant, 1982; Dean and Boulant, 1989).
Кроме того, о существовании внутреннего термочувствительного механизма говорит и тот факт, что частота ТПСП, регистрируемых у теплочувствительных нейронов преоптической области, не затрагивается температурой. Это означает, что некоторые врожденно теплосензитивные нейроны получают синаптические потенциалы (в данном слу- чае ТПСП) от температурно-нечувствительных нейронов. Роль таких входов может заключаться в ограничении частоты разрядов теплосензитивных нейронов, не изменяя их теплочувствительности. Также невозможно исключить и того факта, что эти синаптические влияния увеличивают нейрональную теплочувствительность, так как вызываемое холодом повышение сопротивления может увеличивать амплитуду ТПСП и их длительность, а отсюда и снижение частоты разрядов во время холода.
400
В опытах на срезах мозга крысы регистрировалась электрическая активность нейронов преоптической area-anterior hypothalamus. Исследовалась термочувствительность нейронов при изменении температуры среза. 30% нейронов оказались теплочувствительными, 60% температурно нечувствительны, 10% чувствительны к холоду. Эти результаты совпадают с теми, которые получены при исследованиях на целом животном. Кроме того, предполагается, что гипоталамические термо- чувствительные нейроны не зависят от периферической афферентной импульсации. Все клетки имеют низкий уровень частоты разрядов (менее 10 имп./сек. при температуре 37îС). Более 83% теплочувствительных нейронов были наиболее чувствительны при температуре выше 37îС. Эти данные поддерживают предположение о том, что афферентные входы определяют уровень частоты разрядов и уровень термочувствительности тепловых нейронов. Холодочувствительные нейроны также проявляют максимальную сензитивность при 37îС, что может быть, если они получают ТПСП от рядом расположенных теплочувствительных нейронов (Kelso et al., 1982).
Последовательность тормозных или возбудительных синаптических входов между пейсмекерными нейронами была предсказана математи- чески и через компьютерное моделирование. Парадоксально, что увеличение частоты разрядов может происходить при увеличении числа тормозных входов, а увеличение возбудительных влияний может приводить к снижению частоты разрядов (Perkel et al., 1964).
Ростральный гипоталамус, в особенности preoptic-anterior hypothalamus (POAH), содержит температурно-чувствительные и нечувствительные нейроны, которые формируют синаптическую сеть, чтобы контролировать терморегуляторные ответы. Предварительные исследования заставляют предполагать, что циклический нуклеотид сGMP является важным участником в работе этой нейронной системы, так как микроинъекции cGMP-аналога продуцируют у некоторых видов гипотермию. В проведенном исследовании методами иммуногистохимии показано, что нейроны рострального гипоталамуса содержат сGMP, гуанилат циклазу (необходимую для синтеза сGMP) и CNG A2 (важный канал, управляемый циклическим нуклеотидом). На срезах мозга крысы регистрировалась электрическая экстраклеточная активность от разного типа нейронов в ростральном гипоталамусе. Каждый зарегистрированный нейрон классифицировался в соответствии с его термочувствительностью, так же, как в зависимости от частоты разрядов, вызванных микроМ 8-bromo-cGMP (аналог мембрано-проницаемого сGMP). сGMP
401
имеет специфическое действие на различные нейроны рострального гипоталамуса. В РОАН аналог сGMP снижает частоту разрядов у 45% температурно-чувствительных и нечувствительных нейронов, эффект, который, вероятно, связан с сGMP-усиливаемым гиперпояляризующим током калия. Это снижение активности нейронов РОАН может снизить терморегуляторные ответы и вызывать гипотермию во время экспозиции холодной или нейтральной окружающей температуры. Хотя 8-bromo-cGMP не затрагивает термосензитивность большей части нейронов РОАН, он увеличивал тепловую чувствительность нейронов других гипоталамических нейронов, локализованных в дорзальной, латеральной и постериорной частях РОАН. Это повышение термосензитивности может быть связано с пейсмекерными токами, которые фасилитируются циклическими нуклеотидами. Если некоторые из термочувствительных нейронов, расположенных не в РОАН, провоцируют heat loss или же тормозят продукцию тепла, то повышение их термочувствительности может участвовать в снижении температуры тела, вызываемой сGM (Wright et al., 2008).
Чтобы понять основы термосензитивности таламических нейронов, регистрировалась активность одиночных клеток in vitro от постоянно перфузируемых срезов мозга из преоптической области и anterior hypothalamus (PO/AH). Частота разрядов и термочувствительность отдельных клеток PO/AH определялась перед, во время и после перфузии ткани раствором, содержащим блокатор синаптической передачи в виде повышенного содержания магния или пониженного содержания кальция. Во время синаптической блокады термочувствительность сохранялась почти у всех нейронов, чувствительных к теплу, а некоторые термонечувствительные нейроны проявляли увеличение чувствительности к теплу. Термочувствительность всех холодосензитивных нейронов полностью терялась во время синаптической блокады. Эти результаты поддерживают гипотезу о том, что PO/AH — холодосензитивные нейроны зависят синаптически от теплосензитивных нейронов в их температурной чувствительности, а теплочувствительные нейроны не зависят от свойств нейронов PO/AH областей (Kelso, Boulant, 1982).
Чтобы понять роль гипоталамического дофамина в терморегуляции, регистрировали активность одиночных нейронов in vitro от постоянно перфузируемых срезов преоптической области и переднего гипоталамуса (PO/AH) мозга крысы. Сначала определялась частота разрядов и термочувствительность клетки, затем следили за ее изменением
402
во время и после перфузирования среза раствором, содержащим дофамин. Дофамин возбуждал 41% теплочувствительных нейронов, тормозил 100% холодочувствительных и не оказывал никакого эффекта на 83% температурно нечувствительных клеток. Кроме того, дофамин снижал локальную чувствительность большей части холодочувствительных нейронов. Полученные результаты согласуются с гипотезой о том, что дофамин вовлекается в гипоталамические синапсы, контролирующие синаптические терморегуляторные ответы, препятствующие повышению температуры тела (Scott and Boulant, 1984).
13.10.Пейсмекеры сетчатки
Âсетчатке живых существ разного эволюционного уровня обнаружены клетки, имеющие механизм пейсмекерной активности. Результаты экспериментов показывают, что их функции различны: можно выделить, по крайней мере, два рода задач, в решении которых они принимают участие: во-первых, это формирование циркадианных ритмов, во-вторых, переработка и передача информации о зрительных сигналах.
Нейронными разрядами управляют или синаптические входы, или собственные пейсмекеры клеток. Общепринято, что в спокой-
ном состоянии спайковой активностью ганглиозных клеток управляют синапсы, потому что ретинальные фоторецепторы и клетки второго порядка тонически высвобождают нейротрансмиттер. ON- è OFF-îò- веты ганглиозных клеток генерируют сохраняющуюся активность посредством разных механизмов: ON-клетки зависят от тони- ческого возбудительного входа, который управляет активностью, а OFF продолжают разряжаться в отсутствии синаптических сигналов. В дополнение к спонтанной активности OFF-клетки проявляют другие свойства пейсмекерных нейронов, включая подпороговые осцилляции, берсты (залпы) и последействие. Таким способом разные веса синаптических механизмов и прямых свойств нейронов лежат в основе различий в генерации сохраняющейся активности в этих параллельных ретинальных проводящих путях.
Общим свойством нейронных цепей является то, что они активны даже во время отдыха. Сохраняющиеся разряды нейронов определяются комбинацией синаптичесих входов и собственных свойств нервных клеток. Эти факторы по-разному оцениваются в разных нейронных цепях. У некоторых нейронов (например, у кортикальных пирамидных клеток) остаточная спайковая активность требует участия синаптических входов, а другие клетки (например, пирамиды Пуркинье) управля-
403
ются своими собственными пейсмекерами. Данные о синаптических и пейсмекерных механизмах существенны для понимания того, как работает нейронная цепь.
Ðèñ. 13.30. Пейсмекеры сетчатки. Сохраняющиеся разряды OFF-нейрона при постоянной синаптической блокаде. На нейрограммах показано действие смеси синаптических блокаторов на активность ON-нейрона (А1), OFF T (A2) и OFF S (A3) RGC свето-адаптированной сетчатки. Калибровка: 10 мВ (по Different Mechanisms Generate Maintained Activity in ON and OFF Retinal Ganglion Cells David J. Margolis and Peter B. Detwiler The Journal of Neuroscience, May 30, 2007 · 27(22):5994–6005).
Образы, попадающие на сетчатку, проецируются на фоторецепторную мозаику и передаются в мозг при помощи спайковой активности ретинальных ганглиозных клеток. Существуют и параллельные проводящие пути, специализированные на различных свойствах зрительного образа. Изменения интенсивности освещения, центрального для нашего зрительного восприятия, кодируются отдельными ON- и OFF-прово- дящими путями, двумя главными каналами зрительной системы, которые возбуждаются включением и выключением света соответственно.
404
Двухтактная модуляция скорости разрядов ON- OFF-ответов ганглиозных клеток считается основной в восприятии изменений контраста, яркости и затененности визуальных сцен.
Фоновые разряды ганглиозных клеток отражают баланс между возбудительным центром и тормозной периферией рецептивных полей этих клеток. В ранних работах были описаны различия в фоновой активности ON- и OFF-клеток. Но они не были объяснены. Работы, в которых сравнивали синаптические системы ON- и OFF-проводящих путей, идентифицировали различия по силе и динамике возбудительных и тормозных синаптических входов. Доказано, что различия полностью обеспе- чиваются различием синаптических систем.
Возможность участия собственных свойств нейронов ни разу не рассматривалась. Чтобы изучить участие пейсмекерной активности в фоновой ритмике ON- и OFF-систем, анализировали работу в состоянии покоя, без участия стимулов. Показано, что OFF-клетки в отличие от ON-клеток, генерируют спонтанную активность, которая не управляется синаптическими входами (рис. 13.30). Обнаружены различия в видах спайковой активности, подпороговых осцилляциях, последействии, потенциал-зависимой Са2+ и Na+ проводимости. Эти результаты показывают участие разных механизмов в генерации фоновой спайковой активности ON- и OFF-ретинальных нейронных систем. В работе применяется препарат изолированной сетчатки. Сохраняющейся активностью авторы называют продолжающуюся генерацию спайков в отсутствии света, а спонтанная активность рассматривается как спайковая, когда она генерируется непосредственно клеткой и не зависит от си-
наптических влияний (Margolis and Detwiler1, 2007) .
Пейсмекеры изолированных нейронов сетчатки моллюска
Изолированные пейсмекерные нейроны аплизии лишены любых морфологически специализированных процессов, ответственных за освещение. Нейроны были выделены из сетчатки и отделялись от других ретинальных элементов. Для проведения электрофизиологических исследований их сохраняли в первичной культуре. Мембранные потенциалы снижались, а потенциалы действия возникали при освещении. Световая адаптация снижала ответ и увеличивала латентный период. При фиксации напряжения на мембране нейроны отвечали увеличением входящего тока. Ответы были более медленные, а амплитуда их была меньше, чем у специализированных фоторецепторов. Парные клетки и кластеры монополярных нейронов тоже ответчали на освещение. Эти фоточувствительные монополярные нейроны, вероятно, являются выходными нейро-
405
нами окулярных циркадианных часов. Хотя у аплизии описаны центральные фоточувствительные нейроны, работа Jacklet and Barnes (1993)
— это первое исследование изолированных нейронов сетчатки.
Ðèñ. 13.31. Пейсмекеры сетчатки. Регистрация электрической активности изолированного пейсмекерного нейрона сетчатки. А — спонтанная активность, зарегистрированная в темноте. Уровень МП клетки около -40 мВ, спонтанная активность периодически достигает порога генерации, который находится около -30 мВ. ПД, как правило, достигает максимума между +10 и +20 мВ. Б — ответ пейсмекерного нейрона на инъекцию тока. Нейрон проявляет слабую фоновую активность на уровне МП -40 мВ, но инъекция деполяризационного тока силой 10 пA, длительностью 600 мс вызывает повторные спайки. Инъекция -10 пА гиперполяризационного тока смещает мембранный потенциал примерно до -80 мВ. После инъекции гиперполяризационного тока восстановление МП до исходного уроня происходит медленно, с характерным затуханием (по Barnes S, Jacklet JW Ionic currents of isolated retinal pacemaker neurons: projected daily phase differences and selective enhancement by a phase-shifting neurotransmitter. — J Neurophysiol. 1997 Jun; 77 (6): 3075-84.).
406
Изолированные пейсмекерные нейроны сетчатки отличались по форме, размеру и характеристикам электрической активности от других диссоциированных клеток глаза аплизии. Клеточное тело имеет сферическую форму диаметром 20 микрометров. В них отсутствует окраска, но содержатся маленькие темные включения. Изолированные нейроны генерируют спонтанные потенциалы действия, амплитуда которых достигает 50-60 мВ, а потенциал покоя примерно -40 мВ (у пейсмекерных нейронов, зарегистрированных от интактной сетчатки, МП равен -30 – -60 мВ. На рис. 13.31 показан пример активности изолированного пейсмекерного нейрона с шумом потенциала покоя, который позволяет клетке периодически превышать порог генерации (порог примерно -30 мВ). Потенциал действия обычно достигает максимума между +10 и +20 мВ. Как показано на рисунке, инъекция деполяризационного тока вызывает у пейсмекерного нейрона генерацию спайков, которые проявляют аккомодацию во время коротких залпов вызванной активности. После инъекции гиперполяризационного тока восстановление потенциала покоя происходит в течение 1-2 с. Такое поведение клетки является результатом активации и последующей инактивации быстрого калиевого тока.
Глаз аплизии экспрессирует четкий циркадианный ритм нейронной активности. Для идентификации ионных токов, которые могут играть роль в механизме циркадианных часов, были проведены опыты на первичной культуре диссоциированной сетчатки. Пейсмекерные нейроны имели потенциал покоя около -40 мВ и продуцировали потенциалы действия в темноте с частотой менее 1 Гц. Инъецированный деполяризационный ток приводил к повышению скорости разрядов. Гиперполяризационный ток сопровождался медленно угасающей (1-3 с) следовой гиперполяризацией. При помощи фиксации напряжения на мембране были получены характеристики четырех видов ионных токов: кальциевого тока, вольт(потенциал)-управляемого калиевого тока, активируемого гиперполяризацией тока хлора и А-тока. Фазово-зави- симый калиевый ток показал, что каждый ретинальный пейсмекерный нейрон содержит циркадианные часы, но подтверждение может быть получено только при дальнейшем изучении индивидуальных пейсмекерных нейронов, изолированных полностью от других клеток в первичной культуре. Серотонин увеличивал калиевый потенциал-зависи- мый ток на 29%, что согласуется с сообщениями о том, что серотонин подавляет активность зрительного нерва и сдвигает фазы циркадианного ритма, регистрируемого от интактного глаза. Усиление калиевого
407
тока, вероятно, приводит к гиперполяризации, а это и требуется для фазового сдвига. Из проведенных экспериментов можно заключить, что потенциал-зависимый калиевый ток контролируется посредством циркадианных часов частично, и это может быть необходимым элементов проводящего пути, который активизируется во время вызываемого серотонином фазового сдвига (Barnes, Jacklet, 1997).
Пейсмекерные нейроны сетчатки являются идеальным объектом для изучения ионной основы циркадианного ритмогенеза, что связано с их компактными размерами и высоким входным сопротивлением. В опытах обнаружили, что входное сопротивление от 6,6—+6.6 Гом. Для описания ионных токов применили метод фиксации напряжения на мембране ней-
рона. В опытах были определены свойства четырех видов ионных токов.
Пейсмекеры сетчатки и циркадианные ритмы. Для избирательного разделения функции циркадианного осциллятора глаза аплизии от некоторых его других функций: синхронной генерации сложного потенциала действия, ответа на свет, синаптического взаимодействия между фоторецепторами и выходными нейронами и берстовым пейсмекерным механизмом — использовалась ионизирующая радиация. Низкая доза радиации дает минимальное влияние на циркадианный ритм частоты сложного ПД, измеренной при регистрации от оптического нерва, в то время как радиация высокая уничтожает ритм, не затрагивая четырех других функций глаза. При средней дозе выживает примерно 50% осцилляторной функции. Осцилляции облученного глаза не полностью десинхронизируются, когда ритм уничтожается, потому что in vitro воздействие светтемнота не восстанавливает свободнотекущую ритмичность. Результаты заставляют предполагать, что существует несколько циркадианных осцилляторов в глазу: большая часть их находится сзади вблизи оптического нерва. Тот факт, что восстановление может происходить in vivo , заставляет предполагать, что осцилляторы могут вовлекать молекулы нуклеиновых кислот (Woolum and Strumwasser, 1980).
Циркадианные часы регулируют множество биохимических и физиологических процессов. Ретинальные нейроны, особенно фоторецепторные клетки, содержат автономные циркадианные часы, которые контролируют экспрессию иодопсина, сFos экспрессию, сАМЗ уровень и синтез мелатонина. Культура фоторецепторных клеток, приготовленная из сетчатки эмбриона цыпленка и запущенная ежедневным циклом смены свет-темнота, демонстрировала циркадианные ритмы сАМР уровней и активности arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT), ключевого регулятора энзимов в синтезе мелатонина. Культура фоторецепторов ин-
408
кубировалась в течение 14 часов. В течение 8 дней создавался по 10 часов цикл «свет-темнота». Затем культура переводилась в условия постоянной (24-часовой) темноты. Клетки собирали каждые 4 часа как в фазе чередования освещения, так и в темноте и изолировали РНК. сДНК выделялась из каждого образца, транскрипция часового гена и AANAT измерялась при помощи реакции в реальном времени. Уровень мелатонина определяли через каждые три часа. Оказалось, что клетки, культивированные при экспозиции циклов свет-темнота, демонстрировали ритмическую экспрессию часовых генов. «Часовая» информационная РНК достигала максимума ночью в культуре «день-ночь», но была аритмич- ной в культуре, пребывавшей все 24 часа в темноте. Транскрипция генов Cry1 и Per2 снижалась по амплитуде в постоянной темноте, быстро возрастала рано утром и снижалась ночью. Ритм Per2 снижался по амплитуде в постоянной темноте. Уровень Cr1 и Per2 транскрипции стимулировался при помощи световой экспозиции ночью. Ритмическая экспрессия часовых генов и AANAT не наблюдалась в культуре, не экспонированной в цикле день-ночь. Культура фоторецепторов содержит полную циркадианную систему, которая корректируется циклами свет-темнота и имеет основной часовой механизм и циркадианный выход в виде синтеза мелатонина (Chaurasia et al., 2006).
Трансплантация ткани шишковидной железы в переднюю камеру глаза быстро восстанавливает ритмичность у голубей, аритмичных в результате экстирпации шишковидной железы. Так же передается фаза ритма птицы-донора ритму птице-хозяину. Таким образом, трансплантированная шишковидная железа не дает возможности в точности экспрессироваться ритму, а, скорее, передается осцилляциям, которые контролируют сохранность циркадианной системы и сохраняют способность к самоподдерживаемой ритмичности. Долговременная регистрация, во время которой голубей подвергали воздействиям разнообразных световых условий, обнаружил значительное сходство между циркадианной системой нормальных птиц и птиц, перенесших трансплантацию шишковидной железы (Zimmerman and Menakert, 1979).
Ритмические изменения в транскрипции serotonin N-acetyltransferase у клеток шишковидной железы цыплят контролируется осциллятором, локализованным в самих пинеалоцитах, которые включены в часовые гены. Для регуляции ретинального мелатонинового ритма постулируется необычный, зависящий от часов проводящий путь. У цыплят ретинальные фоторецепторные клетки и пинеалоциты, ген AANAT экспрессируется вместе с часовыми генами (Toller et al., 2006).
409