Нефелометрическое определение количества клеток микроорганизмов или их биомассы

Микроорганизмы в большинстве своем не окрашены и почти прозрачны, поэтому суспензия клеток поглощает свет в видимой области спектра незначительно. Уменьшение интенсивности света после прохождения через суспензию клеток связано главным образом с его рассеянием. В определенных пределах количество света, рассеиваемого суспензией микроорганизмов, пропорционально концент-рации клеток. Общее количество рассеянного света пропорционально отношению размера частицы к длине волны падающего света. Следовательно, при данной длине волны падающего света рассеяние тем больше, чем крупнее клетки микроорганизмов, и для клеток данного размера светорассеяние тем больше, чем меньше длина волны падающего света. Поэтому определять количество клеток по интенсивности светорассеяния можно лишь для тех культур микроорганизмов, которые дают равномерное помутнение среды и их развитие не сопровождается значительным изменением форм и размеров клеток, образованием пленок, мицелия или различных скоплений.

Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной суспензией. Для суспензии бактерий обычно используют красный светофильтр, который соответствует 590 нм.

Величину светорассеяния измеряют с помощью фотоэлектроколориметров. В большинстве случаев для определения количества клеток первоначально строят кривую зависимости показаний фотоэлектроколориметра от числа клеток или их биомассы (калибровочную кривую) и затем по этой кривой, предварительно измерив светорассеяние, определяют содержание клеток.

Построение калибровочной кривой

Для построения калибровочной кривой необходимо приготовить ряд суспензий клеток различной плотности и измерить величину светорассеяния. В каждой из этих суспензий количество клеток определяют в камере Горяева или путем высева на плотные питательные среды.

На основании полученных данных строят калибровочную кривую, откладывая на оси ординат показания фотоэлектроколориметра, а на оси абсцисс – количество клеток, содержащихся в 1 мл среды. Для каждой культуры микроорганизмов строят свою калибровочную кривую.

Ход определения. Количество клеток в исследуемой суспензии определяют по калибровочному графику. Измерив величину светорассеяния анализируемой суспензии, на оси ординат находят точку, соответствующую данному значению, и через нее проводят линию, параллельную оси абсцисс, до пересечения с калибровочной кривой. Из точки пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс и определяют количество клеток в анализируемой пробе.

Используемые питательные среды:

2 %-е сусло-агар. Сусло 4–5 %-е – 100 мл, агар-агар – 2 г. Стерилизуют 20 мин при давлении 0,5 атм.

Задание

1. Построить калибровочную кривую.

2. Определить количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии путем посева на плотную питательную среду, в камере Горяева и по калибровочной кривой.

Контрольные вопросы

1. Какие методы используют для определения количества клеток в суспензии?

2. В чем достоинства и недостатки метода посева на плотные питательные среды?

3. В чем достоинства и недостатки метода определения количества клеток микроорганизмов или их биомассы нефелометрически?