Методы стерилизации питательных сред
Стерилизация предусматривает уничтожение микроорганизмов в стерилизуемом объекте.
Стерилизация автоклавированием. Питательные среды стерилизуют главным образом автоклавированием. Этот способ основан на прогревании субстрата насыщенным паром при давлении выше атмосферного. При повышении давления пара повышается и его температура. Совместное действие высокой температуры и давления пара обеспечивает надежность стерилизации (при автоклавировании погибают вегетативные клетки и споры микроорганизмов). В режиме стерилизации указывают дополнительное давление – 0,5 атм., 1,0 атм. Стерилизацию проводят в специальных герметически закрывающихся толстостенных аппаратах – автоклавах (рис. 1). Это металлический двустенный котел, способный выдерживать высокое давление.
Автоклавы имеют различную конструкцию, но принципиально устроены одинаково.
Среды, предназначенные для стерилизации, наливают не выше половины высоты сосуда. Сосуды закрывают ватными пробками и обворачивают бумажными колпачками.
Автоклавирование проводят следующим образом. Перед автоклавированием в водопаровую камеру наливают дистиллированную воду через воронку 6. В стерилизационную камеру 1 помещают стерилизуемый материал на подставку 9, плотно закрывают и завинчивают крышку автоклава 8. Открывают кран 2, соединяющий камеру с наружным воздухом, и включают нагревающее устройство. Отмечают время, когда у автоклава через кран 2 начнет выходить пар, вытесняющий из автоклава воздух. Необходимо, чтобы из автоклава воздух был удален полностью, поскольку при одном и том же давлении температура чистого пара выше температуры смеси пара и воздуха. Пар выпускают примерно 10–15 мин, иначе в автоклаве останется мало воды.
Рис. 1. Схема автоклава:
1 – стерилизационная камера; 2 – кран для выхода воздуха; 3 – манометр; 4 – предохранительный клапан; 5 – водопаровая камера; 6 – воронка для заполнения автоклава водой; 7 – отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру; 8 – крышка автоклава; 9 – подставка для размещения стерилизуемого материала
После вытеснения воздуха кран 2 закрывают и по манометру 3 следят за повышением давления пара. На манометре отмечается дополнительное давление. При достижении необходимого давления отмечают время и, в соответствии с заданным режимом, проводят стерилизацию. По истечении времени стерилизации нагревание автоклава прекращают. Необходимо дождаться, когда давление в автоклаве сравняется с атмосферным, т. е. стрелка манометра упадет до 0. Затем открывают кран, выводящий пар. После полного выхода пара открывают крышку автоклава.
После стерилизации для проверки стерильности среды выдерживают в термостате 2–3 суток при температуре 30 С.
Температура и длительность автоклавирования определяются, прежде всего, составом питательной среды. Субстраты, содержащие вещества, не выдерживающие нагревания до 120 С (1 атм.), стерилизуют при 110 С (0,5 атм.). Молоко, дрожжевой автолизат, сусло, среды с желатиной стерилизуют при давлении 0,5 атм. в течение 15 мин. Среды, содержащие сахара, витамины и соки, стерилизуют при давлении 0,5 атм., мясопептонный агар автоклавируют при давлении 1 атм., картофельную среду и почвенные вытяжки – при давлении 1,5 атм. в течение 20–30 мин.
Дробная стерилизация сред (тиндализация) применяется для стерилизации сред, не выдерживающих действия температуры выше 100 С. Обработку ведут в аппарате Коха или автоклаве с незавинченной крышкой (стерилизация «текучим паром») 3 раза в течение 30 мин с перерывом в 1 сут. В промежутках между прогреваниями среды помещают в термостат (t = 30 С) для прорастания спор.
Пастеризация – однократный прогрев материала при температуре ниже 100 С – предназначена для уничтожения бесспоровых форм. Среды, не выдерживающие нагрева при 100 С, прогревают более осторожно при 60–80 С в течение 15–10 мин. Пастеризация используется в микробиологической практике для выделения спорообразующих микроорганизмов, а в пищевой промышленности – для обработки продуктов, теряющих вкусовые качества при кипячении (молока, сока, вина, пива).
Стерилизация фильтрованием применяется в тех случаях, когда субстраты не выдерживают температурной обработки (белки, сыворотки, антибиотики, витамины, летучие вещества). Способ заключается в фильтровании жидкостей через специальные фильтры, задерживающие клетки микроорганизмов.
Мембранные фильтры готовят из ацетата, целлюлозы, коллодия. Они представляют собой диски, напоминающие бумажные, толщиной 0,1 мм и диаметром 35 мм. В зависимости от размера пор фильтры обозначаются номерами 1, 2, 3, 4, 5 (минимальный диаметр пор – 0,35 мкм – имеет фильтр № 1, максимальный – 1,2 мкм – фильтр № 5). Для стерилизации наиболее пригоден фильтр № 1.