Метод подсчета клеток дрожжей в камере Горяева
Подсчет общего количества клеток производится под микроскопом в камере Горяева (рис. 2). Камера Горяева состоит из толстого предметного стекла с нанесенными на них поперечными прорезями, образующими три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена на две, каждая из которых имеет выгравированную на ней сетку. Сетка содержит 225 больших квадратов, разграфленных вертикально, горизонтально и неразграфленных .
Рис. 2. Камера Горяева: 1, 2, 3, 4, 5 – поля подсчета клеток
Ход определения. Покровное стекло камеры Горяева притирают к камере до появления так называемых ньютоновских колец. Готовят дрожжевую суспензию, при необходимости разбавляют водой, добавляют 1 каплю 10 %-го NaOH (при микроскопировании пивоваренных дрожжей) и затем из пипетки осторожно вносят под покровное стекло в «бороздки» камеры, расположенные справа и слева от сетки, и микроскопируют. Подсчитывают количество клеток в 5–10 больших квадратах сетки с объективом увеличения в 8 или 40 раз. Число клеток дрожжей подсчитывают, перемещая квадраты по диагонали, или подсчитывают клетки в квадратах согласно рис. 2. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пресекающие верхнюю и правую стороны квадрата. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600. Подсчет клеток рекомендуется начинать не ранее чем через 3–5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости.
Число клеток в 1 мл исходной суспензии рассчитывают по формуле
М
=
,
где А – среднее число клеток в квадрате сетки; H – глубина камеры, мм; S – площадь квадрата сетки, мм2; N – разбавление исходной суспензии; 1000 мм3 = 1 мл;
Площадь большого квадрата сетки равна 1/25 мм2, а глубина камеры равна 0,1 мм.
Подставляя в данную формулу известные числовые данные, ее можно преобразовать и рассчитать концентрацию клеток (Х, млн/мл) по формуле
Х =
,
где n – сумма количества клеток в пяти квадратах сетки, K – разбавление исходной суспензии.
Метод высева на агаризованные питательные среды (метод Коха)
Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний после инкубации. При этом считают, что каждая колония является результатом размножения одной клетки.
Ход определения. Если исследуемая исходная суспензия содержит очень большое число клеток, то необходимо предварительно приготовить ряд разведений культуры. Разведения делают в стерильном 0,9 %-м растворе хлористого натрия или в стерильной водопроводной воде. Чаще всего делают десятичные разведения в соответствии со схемой (рис. 3).
Рис. 3. Схема разбавления суспензии микроорганизмов
В стерильные чашки Петри наливают расплавленное на кипящей водяной бане агаризованное сусло или другую питательную среду по 15–20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не застынет среда. Стерильной пипеткой вносят определенный объем жидкости из соответствующего разведения (0,05–0,2 мл) и делают поверхностный посев. Объем внесенной жидкости равномерно распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Производят двух- или трехкратный посев исследуемой суспензии. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, переворачивая донышком вверх, при температуре 28–30 С. Через 3–5 сут подсчитывают число колоний в чашке. Учитывая степень разведения суспензии и количество внесенной жидкости, высчитывают количество клеток в 1 мл исходной суспензии.