Хенке_Жидкостная хроматография [2009]

3.3. ВЭЖХ в качестве пилотного метода 51

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНОЕ ПРИМЕЧАНИЕ

Из суммарных результатов анализов, зачастую получаемых при традиционном

входном контроле различных продуктов, не всегда могут быть сделаны удовлет ворительные выводы. В представленном случае, исходя из традиционных мето дов, можно только установить, что вторая партия не соответствовала требовани ям, так как она была более полярной, чем первая партия.

3.3.2.3. Олигосахариды

Основными структурными единицами целлюлозы и крахмала являются целлобио

зы, а также мальтоза. Обе структурные единицы – это дисахариды из глюкозы. Бла годаря частичному расщеплению целлюлозы возникает целлобиоза, а из крахмала получают мальтозу. Наряду с этими основными структурными единицами продук ты расщепления содержат также олигомеры в различных количествах в зависимос ти от метода обработки. Так обнаруживают целлотриозу, целлотетрозу и т. д. Хрома тограмма на рис. 3.13а изображает аналитическое разделение целлодекстриновой

смеси, частичный продукт расщепления целлюлозы. Различные моно и олиго сахариды, а также одно и многоатомные спирты, т. е. сильно полярные соедине ния, лучше всего разделять на аминофазах в смеси ацетонитрил вода. Разделение олигосахаридов требует уравновешенного соотношения обоих растворителей. С помощью чистой воды они бы быстро элюировались, но не разделялись, так как в воде они быстро растворимы, а это указывает на слишком быстрое элюиро

вание. С помощью чистого ацетонитрила получилось бы очень продолжительное время элюирования, так как сила элюирования органического растворителя на много ограниченнее вследствие недостаточной растворимости олигосахаридов в ацетонитриле. Отсюда следует, что чистыми растворителями даже на удлиненных колонках нельзя достичь разделения. На рис. 3.13б показано препаративное разде ление одинаковой смеси с помощью добавки глюкозы. В качестве условий разделе ния в аналитической ВЭЖХ были выбраны следующие (см. рис. 3.13).

ГЛАВА 4

ПРИМЕРЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ИЗ ПРАКТИКИ

Следующие примеры показывают пользователю аналитической и прежде всего препаративной колоночно жидкостной хроматографии, какие отчасти простые возможности имеются для того, чтобы быстро и эффективно решать ежедневно

возникающие проблемы разделения. Имеет смысл применять комбинированные методы (например, предварительное разделение по классам полярности может быть очень полезным для количественного разделения).

4.1. Продукты реакции

Количество продуктов реакции, которые получаются в лаборатории, нарабатываю щей органические вещества, может быть принято во внимание, и соответственно это му выбирают подходящий способ очистки, чтобы получить желаемый продукт в чи стом виде. В производстве, как и до этого, широко распространены «классические»

способы очистки и разделения, такие как, например, дистилляция, кристаллизация и экстракция, потому что они, как правило, дешевле хроматографических методов.

Тем не менее во многих случаях, не говоря уже о препаративной газовой хро матографии, не надо отказываться от разделения с помощью колоночно жидко стной хроматографии.

Во многих случаях полярные субстанции не могут быть очищены методом ди

стилляции или существуют комплексные смеси с компонентами, действующими как эмульгаторы. И при разделении энантиомеров препаративная хроматография является выдающимся методом.

Сюда же относится хроматографическая очистка легко деградирующих при родных веществ, таких как протеины и стероиды, а также, в общем, выделение компонентов из экстрактов природных веществ. Конкретные примеры разделе

ния из практики служили в основном для изоляции, количественной оценки и идентификации компонентов различных смесей.

4.1.1. Синтез n фенилендиизоцианата

При синтезе n фенилендиизоцианата возникают промежуточные соединения, та кие как диэтил и диметилуретан, бидиэтил мочевина, амиды, а также смешан

ные производные.

Эти соединения могут быть разделены тонкослойно хроматографически, по средством аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и гель хроматографически в препаративных количествах на Сефадексе LH 20 ко

личественно.

Прежде всего, проводились микропрепаративные разделения на аналитичес ких силикагелевых пластинах (20 × 20 см). Нанесенное количество пробы составля

54 Глава 4. Примеры разделения из практики

Изолированные таким образом компоненты реакционной смеси были иденти фицированы с помощью спектра 1Н ядерной магнитно резонансной спектро скопии, FD/масс спектрометрии и микроэлементарного анализа (определение С, Н, N).

Разделение тонкослойной хроматографией, а также изоляция веществ из слоя представлены на рис. 4.1. Был проведен многократный синтез для получения n фенилендиизоцианата, соответственно, многообразным был состав реакционных смесей. Наряду с тонкослойно хроматографическим разделением был также раз работан аналитический метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). На рис. 4.2 можно видеть разделение реакционной смеси на ZORBAX SIL, т. е. на немодифицированном силикагеле, с помощью гексан этаноловой смеси в качестве подвижной фазы. С упрощением синтеза стал также проще состав реак ционных продуктов. Наряду с диэтиламином применялась не спиртовая смесь, а только метанол, и таким образом представлены реакционные продукты максималь но с тремя компонентами. Хроматограмма на рис. 4.3 изображает препаративное гель хроматографическое разделение простой реакционной смеси на Сефадексе LH 20

метанолом в качестве подвижной фазы. Были выбраны следующие условия раз деления (см. рис. 4.2):

Впрыскивание

мин

Рис. 4.2. Аналитическое разделение методом ВЭЖХ реакционной смеси из синте за n фенилендиизоцианата (уретаны и мочевина)

94 мг

84 мг

Rl – тип детектора

20 мг

2 мг

ч

Рис. 4.3. Препаративное гель хроматографическое разделение производных n фе нилендиизоционата на Сефадексе LH 20

4.1.2.Производные m и n фенилендиизоцианата

Впроцессе синтеза при получении m и n фенилендиизоцианата из производ ных амида кислоты возникают различные дикарбамиды, как промежуточные продукты. (Более точные сведения для синтеза не требуются, так как здесь речь идет, прежде всего о хроматографическом разделении, изолировании и идентифи кации дикарбамидов.) Если используют амин, то налицо чистые m или n дикарба миды. При двойных смесях могут возникнуть 3 различных соединения: два чис тые и один смешанный дикарбамид. Были использованы следующие амины: метил , диэтил и третичный бутиламин. Как правило, применяются два амина:

метил и диэтиламин или метил и третичный бутиламин. Каждая реакционная смесь содержит 3 дикарбамида в различных количествах. Прежде всего, с помо

щью тонкослойной хроматографии на силикагеле (элюент: хлороформ/метанол/ вода 60 : 30 : 1) был получен качественный обзор реакционных продуктов. Для этого – пример с метиламином и третичным бутиламином. На рис. 4.4 можно видеть разделение реакционной смеси тонкослойной хроматографией, рядом

нанесены 3 препаративно изолированные главные компоненты. Для того что

бы сделать быстрые выводы о реакционной смеси, требуется аналитический метод ВЭЖХ. Для вышеназванной реакционной смеси были разработаны усло вия разделения методом ВЭЖХ. Результат этого разделения показан на хрома

56 Глава 4. Примеры разделения из практики

тограмме на рис. 4.4 справа. Были применены разделения как ТХ, так и ВЭЖХ

на всех реакционных смесях.

Уже упомянутое препаративное изолирование реакционных компонентов осу ществилось с помощью метанола на Сефадексе LH 20 (см. рис. 4.3). Изолирован ные дикарбамиды служили идентификации (1H ядерная магнитно резонансная спектроскопия и С , Н , N микроэлементарный анализ), дополнительные коли чества были использованы в качестве стандартов для количественного определе ния высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) в реакционных продуктах.

Интересное наблюдение сделали при разделении методом ВЭЖХ дикарбами дов из m и n фенилендиизоцианата на ZORBAX SIL с помощью гексана/этанола 90 : 10. Появлялись ли чистые или смешанные дикарбамиды, m соединения по являются всегда перед n производными. Возможно, внутримолекулярные водо родные связи снижают у m дикарбамидов способность адсорбции на немодифи цированному силикагеле. У n соединений наоборот функциональные группы (та

Силикагелевая пластина F254, 10 × 20 см

Разделительная система: ZORBAX SIL, 5…7 мкм; 2,1 × 250 мм Подвижная фаза/скорость: гексан/метанол 90 : 10,6 мл/мин Детектор: УФ (ультрафиолетовый), 254 нм

Количество пробы: 8 мкл раствора (0,5…1 мг реакционного продукта/мл подвижной фазы)

n*t*бутил*метил*

Элюент:

Хлороформ/метанол/вода

n*бис*t*бутил*

Фронт растворителя

Пик

Пик

Пик

мин

Реакционный продукт

Рис. 4.4. Разделение методами ТХ и ВЭЖХ n фенилендиизоцианата мочевины на немодифицированном силикагеле

Химические структурные формулы см. табл. 4.1

мин

Рис. 4.5. Аналитическое разделение методом ВЭЖХ смеси дериватов m и n фени лендиизоцианата на немодифицированном силикагеле

кие как –NH– и –СО–) более экспонированные и тем самым более доступные для адсорбционной задержки при образовании водородных связей. На рис. 4.5 показано разделение модельной смеси, состоящей из всех главных компонентов, которые возникли при использовании трех аминов.

Химические структурные формулы см. в табл. 4.1.

Лишь пики 3 и 4, оба m соединения бисдиэтил мочевины и третичной бутилме тил мочевины, имеют идентичное время удержания. В табл. 4.1 представлены схе

матичные хроматограммы со временем удержания и химическими структурными

формулами дикарбамида, а на рис. 4.6 препаративное гель хроматографическое разделение 125 мг реакционной смеси. Условия разделения, как на рис 4.3, но рас ход подвижной фазы составил только 1,5 мл.

4.1.3. Метанолизат моноглицерида

Неполный метанолизат технического моноглицерида олеиновой кислоты состо

ит из нескольких компонентов. Технические моноглицериды изначально явля ются смесью триглицерида, диглицерида (1,3 и меньше 1,2 ) и главных компо нентов моноглицерида в различных количественных соотношениях. При пере этерификации метанолом могут возникнуть как триглицериды, так и диглице

риды в незначительных количествах. Однако предпочтительным является

образование из моноглицерида сложного метилового эфира кислоты жирного ряда и глицерина, т. е. при неполной переэтерификации существует реакцион

58 Глава 4. Примеры разделения из практики

Таблица 4.1. Время элюирования (аналитическая ВЭЖХ), химические структурные формулы соединений при идентичных условиях разделения

мин

мг

4 мг

ч

Рис. 4.6. Препаративное гель хроматографическое разделение смеси m фенилен диизоцианата мочевины с метанолом на Сефадексе LH 20

ная смесь максимально из 5 компонентов при наличии только кислоты жирно го ряда. Соединения различаются величиной (размерами) и полярностью и тем

самым они предназначены для разделения в препаративных количествах с по мощью среднеполярного растворителя в качестве подвижной фазы на Сефадек се LH 20. На рис. 4.7 представлено разделение 910 мг метанолизата с помощью ацетона. Глицерин, самый полярный компонент смеси, после впрыскивания примерно 10 мл метанола быстро элюировал с первой колонки после пика 4, ина че глицериновый пик зарегистрировали бы только через 22 часа. При следую

щих условиях были разделены (см. рис. 4.7).

4.1.4.Эмульгатор для прядильной препарации

Впроизводстве искусственных волокон из полимеров требуется вспомогатель ное средство, такое как прядильные препарации (подробнее о прядильных пре парациях будет рассказано в разделе 5.1), которое состоит из нескольких ком

понентов. Существенной составляющей являются неионогенные эмульгаторы,

как, например, этоксилированный N,N’ бис (2 гидроксиэтил) 5,5 диметилги дантоин в форме сложных эфиров кислоты жирного ряда [4.1]. При примене

60 Глава 4. Примеры разделения из практики

Глицерин элюирует через 22 часа.

ч

Рис. 4.7. Препаративное разделение неполного метанолизата из технического мо ноглицерида олеиновой кислоты

нии стандартных компонентов прядильной препарации эмульгирующие свой ства или другие показатели были не всегда удовлетворительными, т. е. отдель ные партии были разного качества. Достаточно было сравнить 2 или более про дукта друг с другом аналитическим методом, а именно с помощью колоночно жидкостной хроматографии. Поставленные продукты с обозначением этокси

лированный N,N’ бис (2 гидроксиэтил) 5,5 диметилгиндантоин моноолеат были разделены в препаративных количествах (примерно 1 г/разделение) на 6 готовых стеклянных колонках Lobar® LiChroprep RP 8 с помощью метано ла. Разделение одного продукта представлено на хроматограмме на рис. 4.8.

3 пика были изолированы, оценены количественно и затем идентифицирова

ны. Из хроматограммы можно было уже сделать заключение о наличии 3 ве ществ с различной полярностью, так как смесь была разделена на гидрофоби зованном силикагеле. Затем были сделаны спектры 1Н ядерной магнитно резо нансной спектроскопии и их заключения было уже достаточно. Результат разде ления с химическими структурными формулами изображен на рис.4.8. Пик 1 –

это чистый этоксилат, пик 2 – сложный моноэфир и пик 3 – сложный диэфир,

т. е. о чистом моноолеате речь не ведется. Разница между отдельными партиями была в количественных соотношениях 3 компонентов внутри состава. При оп

ределенном соотношении компонентов смеси эмульгирующие свойства были хорошими, либо непригодными, либо с трудом соединяемыми. Более подроб