Хенке_Жидкостная хроматография [2009]

ГЛАВА 3

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ

Хроматографическая разделительная система состоит из неподвижной фазы, или наполнителя колонки, и подвижной, или мобильной, фазы. Благодаря многочис

ленным растворителям и их комбинациям и наполнителям колонок можно раз работать очень много разделительных систем. Исходя из разделяемых смесей ве ществ, можно говорить о двух различных способах разделения. Первый сортирует высокомолекулярные соединения по уменьшающемуся размеру молекул, а вто

рой разделяет низкомолекулярные соединения (размер молекулы < 1000) соглас но разным механизмам разделения, как, например, адсорбция и распределение. Первый способ разделения, известный как гелепроникающая хроматография или молекулярно ситовая хроматография, будет здесь коротко представлена. Для этого метода в распоряжении имеются многочисленные наполнители колонок, на ко торых с помощью водных или органических подвижных фаз можно разделять, а также характеризовать полимеры в разных диапазонах молярных масс, начиная с 1000. С помощью этого метода разделяют не отдельные вещества, а получают толь ко распределение молярных масс, очень важных для характеристики полимеров.

Используемая на практике система разделения должна быть по возможности про стой, это значит, что оптимальной комбинацией независимо от наполнителя коло нок является применение чистых растворителей в качестве подвижных фаз. В срав нении со смесями растворителей регенерация проще, требует меньших затрат и менее проблематична.

3.1. Выбор подходящей системы разделения

При проведении экспериментов нужно выбрать систему или самые лучшие ра створители для разделяемой смеси веществ. Наилучшие шансы для разделения

смеси получаются, если пробу можно примерно одинаково хорошо разделить, как минимум, в двух растворителях. Дело в том, что можно использовать разные сис темы разделения и таким образом быстрее добиться результатов разделения.

На рис. 3.1 представлены различные возможности относительно простых ре шений аналитических и препаративных проблем разделения. На силикагелях, будь то немодифицированные или модифицированные путем химического изменения

свободных силанольных групп, как правило, используют смеси растворителей в

качестве подвижных фаз.

Тем не менее на обращенной фазе С 8 в препаративной области низкого дав

ления можно провести хорошее разделение с помощью чистого метанола, и это будет показано на многих практических примерах разделения. Однако если при

меняют декстрангель Сефадекс LH 20 в качестве наполнителя колонок, то очень

быстро становится понятно, что и с помощью других чистых растворителей воз можны очень избирательные разделения. Разделялись, за небольшим исключе нием, разные низкомолекулярные соединения с молярной массой < 1000. Такие вещества во многом превосходят в числе и многообразии, но не в количестве вы сокомолекулярные соединения (называемые также полимерами), такие как цел люлоза, ее производные, протеины, пластмассы и т. д.

В дальнейшем подробнее остановимся на уже названном рис. 3.1. В зависимос ти от растворимости пробы для сепарации смесей веществ могут быть привлечены лишь немногие разделительные системы или, наоборот, многочисленные.

3.1.1. Растворимость в растворителях

3.1.1.1. Растворимость в метаноле

Если проба хорошо растворима в метаноле, то можно исходить из того, что ацето нитрил также может приниматься в расчет как растворитель. В этом случае мно гие гели могут использоваться как наполнители колонок, так как компоненты пробы тоже могут определять, какой из многочисленных материалов лучше всего подходит для разделения смеси. На обращенных фазах – гидрофобизованных си ликагелях производят разделение с помощью метанол водных или ацетонитрил

водных смесей по снижающейся полярности. Это касается в основном аналити ческих разделений. Однако если используют препаративные колонки низкого дав ления, то благодаря нескольким последовательно включенным колонкам можно достичь с помощью чистого метанола или ацетонитрила очень хороших, частич но более хороших разделений в бóльших количествах, хотя и несколько медлен нее. Особенно хорошо подходят аминофазы для разделения полярных соедине

ний, таких как, например, олигосахариды. В аналитической ВЭЖХ применяют водные подвижные фазы, а при препаративных разделениях достигают, по мень шей мере, такого же результата с помощью чистых органических растворителей. На декстрангеле Сефадекс LH 20 с помощью чистого метанола также могут про водиться в препаративном масштабе очень избирательные, детерминированные функциональными группами, разделения. В гл. 4 будут представлены многочис

ленные аналитические и препаративные разделения различных смесей веществ с помощью метанола.

3.1.1.2. Растворимость в дихлорметане

Дихлорметан очень хорошо подходит как растворитель и тем самым как подвиж ная фаза при разделении среднеполярных и слабо выраженных гидрофобных со единений. В качестве наполнителя колонок применяются немодифицированные силикагели, а также среднеполярные СN фазы. В аналитической ВЭЖХ дихлор метан наряду с другими органическими растворителями является компонентом

подвижных фаз. На препаративных колонках низкого давления можно, однако,

хорошо использовать также чистый дихлорметан как элюент, благодаря тому что несколько колонок соединяют последовательно.

Чистые растворители имеют особенно большое преимущество в том, что их регенерация из подвижной фазы не составляет проблем и, как правило, недоро

34 Глава 3. Хроматографические разделительные системы

гая – очень важный фактор в препаративной колоночной жидкостной хромато графии.

На Сефадексе LH 20 могут проводиться с помощью дихлорметана избира тельные разделения по увеличивающейся полярности и электроотрицательнос ти. Разделения на декстрангеле во многих случаях более селективны, чем на не модифицированном силикагеле, и размытие тыла пика наблюдается очень ред ко. Протонируемые силанольные группы на поверхности силикагеля придают неорганическому гелю сильную полярность и кислотность. Эта особенность ве дет к усиленному замедлению, а также к асимметричному элюированию сла боосновных соединений. Благодаря соответствующему насыщению силаноль ных групп, например, небольшими количествами диэтиламина в подвижной фазе или в элюенте (тонкослойная хроматография – ТСХ) можно предотвра тить сильную адсорбцию, связанную с выраженным размытием заднего фронта пика.

У декстрангеля, наоборот, хотя это тоже сильно полярный наполнитель коло нок, именно функциональные ОН группы способствуют частично очень силь

ной адсорбции, но лишь в незначительных случаях наблюдается размытие задне го фронта пика, так как спиртовые группы имеют очень малую кислотность.

3.1.1.3. Растворимость в этилацетате

Для этилацетата (этиловый эфир уксусной кислоты) действительно то же самое, что и для дихлорметана, лишь с дополнительным замечанием, что из этого ра створителя слабо , средне и сильнополярные соединения при элюировании еще сильнее задерживаются сильнополярными гелями, т. е. прохождение растворен

ных веществ замедляется.

3.1.1.4. Растворимость в ацетоне

Ацетон при использовании силикагелей редко применяется в качестве компонента подвижных фаз. Более эффективным для этого является применение в препара

тивной гель хроматографии на Сефадексе LH 20. Ацетон в элюотропном ряду элю ентов на оксиде алюминия распределяется по категории между дихлорметаном (бо лее неполярный) и этилацетатом (более полярный). С помощью Сефадекса LH 20 он образует, как и дихлорметан и этилацетат, очень избирательную разделительную систему. Это свойство, такое важное для препаративной гель хроматографии, бу дет подтверждено конкретными примерами разделения из практики.

3.1.1.5. Растворимость в воде

Нередко, и это еще раз подчеркивается, многочисленные вещества почти одина ково хорошо растворяются в самых разных растворителях. Так, соединения могут показывать приблизительно одинаковую растворимость в метаноле, ацетоне и воде. Для разделения низкомолекулярных, полярных соединений годятся все по

верхностно модифицированные силикагели, у которых вода является компонен

том подвижной фазы.

Препаративные разделения можно очень хорошо проводить с водой на декст рангелях Сефадекс G 10, G 15, G 25 и LH 20. Обозначение LH значит, что гель

обладает как липофильными (L), так и гидрофильными (H) качествами, благода ря чему для образования разделительных систем в качестве подвижных фаз мож но использовать и слабо , и сильнополярные растворители.

Сефадекс типов G годится только для разделений в водных средах, при этом сепарация происходит не только исключительно по уменьшающемуся размеру молекул или молярной массы. Уже довольно часто наблюдались также эффекты адсорбции, которые не редко приводят к количественным разделениям. Адсор бция обозначает, что характеристические признаки молекул, а это функциональ ные группы, замедляют элюирование соединений. Это приводит к селективным разделениям. Единственным недостатком воды, как подвижной фазы, в препа ративной жидкостной хроматографии является то, что при выпаривании фрак ций элюата требуются повышенные затраты энергии. Щадящая изоляция чув ствительных субстанций из воды может происходить также путем сублимаци онной сушки.

В разделах 3.1.2 и 3.1.3 будет показано, какие соединения или продукты раз деляются аналитически и в препаративных количествах на различных наполни

телях колонок с названными подвижными фазами (раздел 3.1.1). На рис. 3.1 объе динены конкретные предложения по разделению. Практическое значение раз личных разделительных систем тем самым становится еще более значимым.

3.1.2. Аналитические разделения

На обращенных фазах С 8 и С 18 и аминофазе с помощью смеси метанола и воды или ацетонитрила и воды разделяются:

•химикаты, используемые в производстве изделий из резины,

•следы диизоцианата в полиуретановых экстрактах,

•антиоксиданты,

•олигосахариды.

На немодифицированном силикагеле и CN фазе c помощью этилацетата или дихлорметана в подвижной фазе разделяются:

•простые и сложные эфиры кислот жирного ряда и одно и многоатомных спиртов,

•полно и частично алкилированные производные сахара.

3.1.3. Препаративные разделения

На обращенных фазах С 8 и С 18 и аминофазе с помощью метанола, ацетонитри ла или смесей метанол вода, а также ацетонитрил вода разделяются:

•прядильные препарации и их компоненты,

•алкилполигликозиды,

•антиоксиданты,

•олигосахариды.

На немодифицированном силикагеле и CN фазе с помощью этилацетата или

дихлорметана в подвижной фазе разделяются:

36 Глава 3. Хроматографические разделительные системы

•насыщенные и ненасыщенные сложные эфиры кислот жирного ряда одно и многоатомных спиртов,

•полно и частично алкилированные производные сахара.

На Сефадексе LH 20 разделяются:

•с помощью метанола:

прядильные препарации и их компоненты, различные продукты реакции, разные экстракты, натуральные вещества и лекарства;

•с помощью ацетона:

компоненты полиуретана, насыщенные и ненасыщенные сложные эфиры

кислот жирного ряда одно и многоатомных спиртов, ПЭГ (полиэтилен

гликоль) 200 и ПЭГ 400 сложного диэфира кислоты жирного ряда, а также сложного моноэфира кислоты жирного ряда;

•с помощью дихлорметана:

насыщенные и ненасыщенные сложные эфиры кислоты жирного ряда одно и многоатомных спиртов, простой дифениловый эфир в полигликолевой кислоте и разные реакционные продукты.

•с помощью воды:

обогащение диаминодигексиламина в найлон 6,6 гидролизатах, декстри новые смеси, олигосахариды, воднорастворимые производные лигнина и неорганические соли.

3.2.Тонкослойная хроматография (ТХ)

вкачестве пилотного метода

ТХ в качестве пилотного метода применима для аналитической ВЭЖХ и для препа ративных разделений. Чем проще система разделения в ТХ, тем быстрее может про исходить перенос с пластинки на колонку, будь то аналитический или препаратив ный. Проще всего использовать однокомпонентные растворители в качестве элюен та, так как в таких случаях легко масштабировать процесс. В литературе о ТХ приво дятся лишь немногие примеры, насколько хорошо можно выполнять разделение с помощью чистых растворителей, хотя многочисленные смеси веществ можно хоро шо разделять однокомпонентными элюентами. При применении двухкомпонентных элюентов нужно учитывать, что в ТХ имеется градиент элюента. Поэтому, когда реа лизуется перенос с пластинки на колонку, существует следующее правило: если при

разделении методом ТХ используют наряду со средне или слабополярным раство рителем 20% полярного растворителя, то при разделении в колонке нужно использо

вать примерно 2% такового. Дело в том, что через колонку подвижная фаза протекает с неизменяемым составом, это значит, при более высокой доле полярных компонен тов сила элюирования элюента была бы слишком большая.

Далее будет показано на конкретных примерах, как просто перенести анали

тическое разделение ТХ с помощью чистого растворителя на сравнимую препа

ративную колонку низкого давления. Эта комбинация представляет большой ин терес для практиков, которые хотят простыми средствами достичь оптимальных условий для своего препаративного метода.

38 Глава 3. Хроматографические разделительные системы

• Изоляция и идентификация главных компонентов реакционной смеси.

В зависимости от проведения реакции при синтезе n фенилендиизоцианата

появляются различные промежуточные продукты. Эти производные n фенилен диизоцианата можно было количественно разделить на силикагелевой пластине

с помощью смеси хлороформа и метанола в соотношении 96 : 4.

Как уже упоминалось, переносы на колонку методов с использованием двух компонентных смесей растворителя не составляют проблемы. В этом случае надо,

однако, отметить, что потребовалось не 10%, а 50% полярного компонента, т. е.

метанола, чтобы достичь на колонке сравнимого количественного разделения.

Разделение методом ТХ можно видеть на рис. 3.3 слева, препаративное выделе ние соответственно справа. В этом случае идентифицировались также 3 главных компонента реакционной смеси на основе данных анализа 1Н ядерной магнит но резонансной спектроскопии и микроэлементарного анализа. На протониру емых силанольных группах сильнее всего задерживается бисдиэтил мочевина,

Производное n%фенилендиизоцианата

Проба = реакционная смесь

Пик

Пик

Пик

ч

Рис. 3.3. Перенос разделения с пластины для ТХ на колонку низкого давления

3.3. ВЭЖХ в качестве пилотного метода 39

так как этот компонент обладает наивысшей основностью. Смешанное произ водное количественно элюируется еще перед диметилуретаном.

3.2.2.Перенос с ТХ на колоночную хроматографию

спомощью Сефадекса LH!20

ТХ на силикагеле можно очень хорошо применять в качестве пилотного метода для препаративных разделений на Сефадексе LH 20. Нельзя сравнивать такие наполнители колонки, как силикагель и декстрангель, так как это в корне раз личные материалы. Силикагель – это устойчивый к давлению неорганический

материал, а Сефадекс LH 20 это набухающий, т. е. чувствительный к давлению органический гель.

Их объединяет одно: оба сильно полярные гели, но с той разницей, что в си ликагеле силанольные группы имеют кислотный характер, а у декстрангеля нет спиртовых групп. Кислотность силикагеля ведет к тому, что основные соедине ния могут сильно задерживаться или необратимо адсорбироваться.

ВТХ это свойство выражается в размытии заднего фронта пика на пятнах, и из колонки пики элюируются с размытым пиком. Эти эффекты могут появляться

ииз за чрезмерной нагрузки, но здесь они не обсуждаются. У силикагелей с обра ботанной поверхностью могут проявляться остаточные силанольные группы при разделении основных соединений.

Входе проведения предварительных экспериментов на силикагелевой плас тине хорошо себя зарекомендовали дихлорметан, этилацетат и ацетон в качестве чистых однокомпонентных элюентов. Эти растворители являются также подвиж ными фазами в препаративной гель хроматографии на Сефадексе LH 20.

3.3. ВЭЖХ в качестве пилотного метода

Аналитические разделения ВЭЖХ в качестве пилотного метода для препаратив ных разделений в области высокого, среднего или низкого давления могут приве сти к хорошим результатам. Перенос аналитического разделения на препаратив

ную колонку, как правило, не составляет проблемы. Однако может случиться, что 2 одинаковых наполнителя колонки разных изготовителей с одинаковой подвиж ной фазой приведут к разным результатам разделения. Если используют обращен ные фазы, то желательно перед переносом проверить следующее:

•растворимость пробы в смесях метанол вода или ацетонитрил вода,

•летучесть водяного пара компонентов пробы и

•устойчивость разделенных субстанций к гидролизу.

Если даже одно из условий не выполнено, то следует вернуться к методу ана

литического разделения ВЭЖХ на обращенных фазах, к сожалению редко прак

тикуемому. Тем самым можно использовать разделение метанол водных или аце

тонитрил водных смеси до соотношения 85 : 15 (есть много таковых) с помощью чистого органического растворителя на последовательно соединенных препара

тивных колонках низкого давления. Во избежание потерь драгоценного времени

40 Глава 3. Хроматографические разделительные системы

замедленные препаративные разделения на колонках низкого давления можно проводить также и в ночные часы. Автоматическая дозировка проб и применение гибкого сборника фракций делает это возможным.

3.3.1. Перенос с аналитической ВЭЖХ на препаративную ВЭЖХ

3.3.1.1. Реакционный продукт

•Ароматический дисульфид

Оба нижеследующих разделения, аналитический и препаративный (рис. 3.4), наглядным образом показывают, какая разница в селективности может быть между двумя СN фазами с одинаковой величиной частиц. Препаративное разделение было возможно после того, как вместо этилацетата (этиловый эфир уксусной кис

лоты) был использован полярный этанол наряду с гексаном в качестве второго компонента элюента. Для полярного этанола потребовались незначительные объемные доли. Так как основные функциональные группы для адсорбционного взаимодействия менее доступны в орто положении, соединения с аминогруппа ми в пара положении (пик 3) запаздывают сильнее. Часто бывает так, что ско рость подвижной фазы на препаративной колонке должна быть меньше, так, что

здесь вместо 29,5 только 11 мл/мин.

Изометрия положения

Рис. 3.4. Аналитическое и препаративное разделение методом ВЭЖХ реакционной смеси